生物学基因克隆的载体.pptxVIP

第一节 质粒载体 第二节 λ噬菌体载体 第三节 粘质粒载体 第四节 M13噬菌体载体及噬菌粒 第五节 真核细胞用载体 第六节 人工染色体;第一节 质粒载体; 带pMBI（或ColE1）复制起点的质粒在复制起始阶段所产生的转录物的方向及其粗略大小; 质粒不亲和现象图解;2、比较pBR322和pUC18/19 pBR322质粒限制性内切酶图谱 ; pUC18/19质粒的限制性内切酶图谱; pUC18/19质粒的多克隆位点;多克隆位点 筛选标记 α互补 拷贝数 分子量;乳糖操纵子模型;IPTG 非代谢诱导物 Xgal（无色） β-半乳糖苷酶 半乳糖+5-溴-4-氯靛蓝（深蓝色） β-半乳糖苷酶Xgal显色反应检测法 质粒 编码β-半乳糖苷酶氨基末端（ α –肽段） 宿主细胞 编码缺陷型β-半乳糖苷酶（失去正常的氨基末端） ;单独都不能产生有活性的β-半乳糖苷酶 两者结合在一起，才能形成有功能的β-半乳糖苷酶（α互补） lacZ’内，具有一段多克隆位点序列（MCS） 在正常情况下，插入到MCS的外源DNA片段，都会阻断α-肽链的合成，因此含有重组质粒载体的克隆是无色的，它可以与含有非重组质粒载体的克隆形成的蓝色“背景”明显地区别开来 ;3、比较pGEM和pUC18/19 ;含有噬菌体的启动子，可合成RNA 用途： 杂交探针 体外翻译 体外剪切反应;4、T载体 pMD18-T Vector 高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体，由pUC18载体改建而成 在 pUC18载体的MCS位点处的Xbal和Sal识别位点之间插入EcoRV识别位点， 用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3’端添加“T”而成。 大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在 PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性 ;;5、E.Coli的表达载体 表达载体和克隆载体的主要区别： 强启动子和终止序列 E.Coli：SD序列 ;真核生物基因在原核生物E.Coli中表达 转录 翻译 翻译后修饰;诱导表达和分泌表达 PBV221限制性内切酶图谱（30 ℃ / 42℃ ） ; 信号肽 一般特征： 含13-26个氨基酸残基， 在或靠近其N端有 一至多个带正电荷的 氨基酸， 在中部为由10-15个氨基酸 （大部或全部是疏水性的） 组成的疏水核 pTA1529质粒含大肠杆菌phoA基因的启动子和信号肽序列;;;第二节 λ噬菌体载体;溶源 寄主细胞仍然存活着并持续地进行细胞分裂，不产生子代噬菌体颗粒 溶菌 寄主细胞因裂解而致死，释放出许多噬菌体颗粒; λDNA限制图谱;2、Charon系列载体 构建基因组文库 Charon28的限制性酶切位点（5-24Kb）;3、EMBL系列载体 构建基因组文库 MboⅠ、BamHⅠ、BglⅡ、BclⅠ、XhoⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ EMBL3和EMBL4的限制性酶切位点（23Kb） ;4、λgt系列载体 构建cDNA文库（6-8.2Kb)） 表达 Λgt11载体的限制性酶切位点;利用特异性抗体作为探针筛选Λgt11表达文库;插入位点位于LacZ基因的C末端，可作为β-半乳糖苷酶融合蛋白表达； 可用抗体探针筛选 蓝白斑筛选 温度敏感诱导表达 裂解基因中的琥珀突变 ;UAG 琥珀型 amber