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PAGE PAGE 1 选修3专题1基因工程复习提纲 高二一部生物 李真真2016/4/22 基因工程的概念 1.基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 2、其操作水平在DNA分子水上进行设计和施工。 3、操作环境是在生物体外。 1.1基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） 来源 多数来自原核生物 作用 切割双链DNA分子 特点 识别特定的核苷酸序列，并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，因此具有专一性。 结果 形成黏性末端或平末端 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”——载体 （1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒 1.2基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因 。 2. 获取方法：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增、人工合成（反转录法_和化学合成法_）。 1）基因文库、基因组文库及部分基因文库 ①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 ②基因文库种类：基因组文库（含有一种生物的全部基因）、部分基因文库（含有一种生物的部分基因如cDNA文库）。 2)PCR技术扩增目的基因 （1）原理：DNA双链复制原理 （2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链； 第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链； 第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。 （3）PCR技术与DNA复制的比较 　 DNA复制 PCR技术 区 别 场所 细胞内 生物体外 酶 DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶 耐热的DNA聚合酶(Taq酶) 温度条件 细胞内温和条件 在较高温下进行 解旋的方式 解旋酶催化 高温下变性解旋 结果 形成整个DNA分子 短时间内形成大量的DNA片段 联系 模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板 原料：均为四种脱氧核苷酸(即dCTP、dATP、dGTP和dTTP) 酶：均需要DNA聚合酶进行催化 第二步、基因表达载体的构建 1）.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2）.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 （1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。 （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。 第三步：将目的基因导入受体细胞_ 1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.常用的转化方法： 　 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法(主要)，基因枪法和花粉管通道法 显微注射技术，病毒感染法 Ca2＋处理细胞法 受体细胞 受精卵或体细胞 受精卵 微生物细胞 转化过程 构建重组质粒→农杆菌→导入植物细胞→整合到植物细胞的DNA上→表达 构建重组质粒→显微注射→受精卵→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组质粒与感受态细胞混合→重组质粒进入感受态细胞 第四步：目的基因的检测和表达 1.目的基因的检测与鉴定 类型 步骤 检测内容 方法 结果 分子检测 第一步 目的基因是否进入受体细胞 DNA分子杂交(DNA和DNA之间) 是否成功显示出杂交带 第二步 目的基因是否转录出信使RNA 分子杂交技术(DNA和RNA之间) 第三步 目的基因是否翻