大鼠单核细胞分离.docVIP

大鼠单核细胞分离（HISTOPAQUE 1083说明书） 仪器和试剂：RPMI 1640或PBS缓冲液， 离心管（15ml、50ml）， 移液管， 离心机（带转桶 可提供400-1000×g的相对离心力） 大鼠单核细胞分离液体（sigma LTS1083-1） 实验原理 将抗凝血置于HISTOPAQUE 1083上层。在离心过程中，多聚糖引起红细胞聚集并迅速沉降；然而，淋巴细胞和其它单核细胞保留在血浆—HISTOPAQUE 1083分界处。红细胞聚集成团沉至离心管底。由于粒细胞密度升高，它们并不会和单核细胞混在一起而是向离心管底移动。大多数不相干的血小板在冲洗过程中被低速离心清除掉了。 实验步骤 向离心管中加1083-1单核细胞分离液 3ml离心液—15ml离心管；15ml离心液—50ml离心管 小心将全血置于1083-1离心液表面上 3ml全血—15ml离心管；15ml全血—50ml离心管 室温下以400×g的相对离心力离心30min。须关闭离心机的制动开关。低温离心可能会导致细胞聚集或复苏延迟。 离心结束后，小心吸去最上层液体至含单核细胞的不透明层2-3mm。弃掉吸取的最上层液体。 用吸管小心将单核细胞层吸取并转移到15ml圆锥形离心管中。 加等渗PBS溶液或细胞培养液（无血清）至离心管中，10ml—15ml离心管 / 30ml—50ml离心管。上下翻转离心管摇匀。 以250×g的相对离心力离心10min。吸弃上清液。 用0.5ml等渗PBS溶液或细胞培养液，重新悬浮离心后的细胞。之后添加适量等渗PBS溶液或细胞培养液，4.5ml—15ml离心管 / 14.5ml—50ml离心管。 以250×g的相对离心力离心10min。吸弃上清液。 重复第8-9步。基本上需要冲洗2-3遍便能将单核细胞中的残留分离液洗净。最后一遍冲洗完成后，以等渗PBS溶液或细胞培养液重新悬浮细胞，0.5ml—15ml离心管 / 1.5ml—50ml离心管。 此时可根据个人所需进行各项检测。 400×g近似于1500rpm；250×g近似于100rpm 四、注意事项 1. 用于分离的血液须新鲜且没有血凝块。使用不含防腐剂的抗凝剂采集静脉血。为求最佳结果应尽快使用血液样本。过晚使用血液样本会导致细胞复活能力下降或丧失活力。EDTA和肝素是常用的的抗凝剂。EDTA的抗凝剂量在1.25-1.75mg/ml。肝素的抗凝剂量为15-30u/ml。肝素抗凝血的细胞复活力在2小时后明显下降。EDTA抗凝血的细胞复活力在2小时后下降，6小时后明显。 2．采用这种方法获取的细胞系的纯度可通过流式细胞仪、或者将第10步收集的细胞在细胞离心涂片器上行罗曼诺夫斯基氏染色进行检测。晾干的细胞悬液制成的涂片会有明显的缺陷。细胞离心涂片器制备的涂片可较好的保持细胞形态，因此强烈推荐采用此种方法。 3. 细胞活力可通过台盼蓝染色的方法进行检测。如果细胞活力80%，使用细胞培养液如RPMI 1640 添加5%胎牛血清替带PBS平衡盐溶液可帮助提高细胞活力。 4. 血液稀释可采用这种方法。使用等张PBS溶液或适合的细胞培养基稀释血液。推荐的稀释比例是1份血液加1份稀释溶液中。骨髓细胞则需根据细胞计数结果将次比例提高到1:2或1:4。 5. 清除过多含单核细胞的HISTOPAQUE 1083会增加粒细胞污染。 6. 清除过多的含单核细胞的血浆会增加血浆蛋白或血小板污染。 7．为清除污染的血小板，须再次进行离心。可将单核细胞置于去离子水配制的8.125%蔗糖溶液上层。将单核细胞置于蔗糖上层并以300×g的相对离心力离心10-15min。血小板无法穿过蔗糖溶液层，但是单核细胞可以穿过。也可以将蔗糖溶液置于HISTOPAQUE 1083上，从而将单核细胞固定在蔗糖/Histopaque界面处。 8. 如果实验动物非大鼠或小鼠，则需对实验方案进行修改。