大鼠肝微粒体的制备.docVIP

2.1.3 大鼠肝微粒体的制备 大鼠肝微粒体制备全过程： 1．购买实验动物 SD 大鼠，20 只，雌雄各半，体重（180-220）g，广州中医 药大学实验动物中心提供。合格证号：0055706 2．大鼠肝脏灌流 购买的大鼠当天腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg·kg-1 ）， 使其麻醉，利用酒精进行常规消毒后，打开腹腔暴露肝脏，肝门静脉处进行插管并 固定。结扎上腔静脉，剪破下腔静脉用磷酸盐缓冲液进行灌流，直至肝脏颜色呈土 黄色。 3．灌流好的肝脏取出后按1：4 比例放入装有磷酸盐缓冲液（含1mM EDTA ,0.25M 蔗糖）的匀浆管内，剪碎，匀浆。 4．将匀浆液倒入50mL 高速离心管中在4℃条件下9000g 离心20 min。 5．保留上清并转移到超速离心管中，在4℃条件下100000g 离心60min。 6．保留沉淀并重新混悬于磷酸盐缓冲液（含0.9%的NaCL）中, 4℃条件下 100000g 再离心60 min，得到的沉淀即为肝微粒体。 7． 将肝微粒体重悬于0.1M 磷酸缓冲液（PH7.4，20%甘油，1mM EDTA， 0.25M 蔗糖）中于-70℃冰箱保存，其中留取一小管用于蛋白浓度测定。 8．微粒体蛋白浓度测定 依据的是Lowry et. al.方法(Lowry et al.,1951)，首先用 牛血清白蛋白标准溶液配置成不同浓度的蛋白标准溶液，与斐林试剂混匀发生反应 后测定蛋白浓度，根据吸光度A 和蛋白浓度C 进行线性回归并绘制标准曲线。同 样的方法测定肝微粒体的吸光度，根据标准曲线线性回归方程计算肝微粒体蛋白浓 度。 9．肝微粒体中P450 酶含量测定 根据Omura and Sato 的方法(Omura and Sato,1964)，用Tris-HCl 缓冲液把肝微粒体样品稀释至0.3?0.5 mg/mL，取两份肝微 粒体分别放于参比池和样品池， 400 nm～500 nm 扫描基线；参比池和样品池都加 入少量Na2S2O4，轻微搅拌，并给样品池通CO 气体30 s，再次扫描，记录450 nm 和490 nm 处的吸光度，按Beer 定律（公式2.1）计算CYP450 的含量。 CYP450 (nmol/mg protein) = (A(450－490) × 1000)/(91 × C) (2.1) 其中，A(450－490)为450 nm 和490 nm 处的吸光度之差，91 为CYP450-CO 结合 物的摩尔消光系数，C 为肝微粒体样品的蛋白浓度（mg/mL。 实验五肝细胞微粒体的制备和细胞色素P450 氧化酶活性测定 一、目的要求 1. 掌握肝细胞微粒体的制备和细胞色素P450 氧化酶活性测定方法。 二、实验原理 外来化学物质在体内的生物转化主要靠肝细胞内滑面内质网上细胞色素P450 酶 （CYP450）系进行氧化、还原、水解等代谢。许多药物对细胞色素P450 酶系活性有抑制或 诱导作用，当与其他需经CYP450 代谢的药物联合应用时，会影响这类药物的代谢，从而产 生药物相互作用。制备肝细胞微粒体，并测定其内细胞色素P450 酶系的含量与活性，可为 进一步研究外来化学物质物对肝微粒体细胞色素P450 酶系的影响提供依据。 肝微粒体细胞色素P450 酶系活性测定中，本实验首先应用Lowery 法测定肝微粒体蛋 白浓度，其显色原理为Flion酚试剂与蛋白质的酪氨酸和色氨酸残基反应所致。细胞色素P450 含量测定采用CO 还原差示光谱法，还原型细胞色素P450 可与一氧化碳结合，在波长450 nm 处出现最大吸收峰，因此可应用紫外分光光度计于波长450 nm 处进行测定，而氧化型细胞 色素b5 经还原剂作用后转变成还原型细胞色素b5，在波长423 nm 处呈最大吸收，因此可 通过测定还原型与氧化型细胞色素b5 的差示光谱来进行。 三、仪器与试剂 实验动物：Wistar 大鼠，雄性，体重212±13 g。 主要试剂：羧甲基纤维素钠，氨基吡啉，红霉素，7-乙氧基香豆素，NADPH，牛血清 白蛋白，甲醛。 实验仪器：紫外/可见光分光光度计，荧光分光光度计。 四、实验步骤 1. 给药：8 只雄性Wistar 大鼠，给予0.25%羧甲基纤维素钠1 ml，每日灌胃1 次，连续 7 d。d 7，禁食1 夜，次日断头处死。 2. 动物处理与肝微粒体蛋白的测定大鼠断头处死，尽量放出血液，迅速打开腹腔， 取出肝脏，用0.15 mol·L-1 KCL-0.2 mol·L-1 蔗糖（pH 7.5）洗净表面血污，用滤纸吸去表 面血液，称肝重。将肝脏剪碎，用上述缓冲液洗2 次，充分去除肝脏血液。按每克肝脏组织 加3 ml 缓冲液的比例加入0.15 mol·L-1 KCL-0.2 mol·L-1 蔗糖，用内切式组织匀浆机在冰 浴中