免疫组化IHC.docVIP

免疫组化 原理 免疫组化（immunohistochemisty），简称IHC，是应用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，对组织细胞内抗原进行定位、定性及相对定量研究的实验方法 试剂耗材 4%多聚甲醛，梯度酒精（75%，80%，90%，95%，100%I,II,III），二甲苯，正丁醇，石蜡，抗原修复液（配置），一抗，二抗，苏木素，DAB显色液，氨水，中性树脂，盖玻片 实验方法 取材 颈椎脱臼法处死小鼠，剪取所需的组织。 注意事项： ①取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 ②切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。 切片制备 固定 将取好的组织用PBS冲洗一下，立即投入4%多聚甲醛（PFA））中4℃固定； 神经组织，脑≤8h ； 其他组织固定时间：10h(适当调整) ，固定完全即可。 注意事项： ①固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20-30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。 ②为了保证组织的新鲜度，尽可能取出后立即放入固定液。 洗涤 取出固定液中的组织，流水下冲洗30min（可调整）至固定液冲洗完全 脱水 用的脱水剂是酒精，将组织依次经75%，80%，90%，95%，100%I,II,III，各1h，目的是脱水，因为透明剂多是苯类，苯和水不互溶。 注意事项： ①脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。 在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。 透明 用的透明剂是二甲苯，由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯,目的是脱酒精。 正丁醇 过夜 二甲苯I 30min-1h 二甲苯II 30min-1h 注意事项： 在透明过程中，如果组织周围出现白色雾状，说明组织中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。 浸蜡和包埋 浸蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗浸到组织内部达到饱和程度以便包埋。 石蜡I 可过夜 石蜡II 1h-3h 石蜡+适量蜂蜡 包埋用 烤箱温度设置为(65-70)℃。 注意事项： 包埋后的蜡块需冷却完全再放置-20℃，否则蜡块会裂开,蜡块不能在-20℃过夜。 切片，捞片与烤片 先将切下的组织薄片放置在冷水中，蜡片于温水中（45°C左右）中展平，捞至载玻片上铺正，将载玻片放入60℃温箱中干燥。 切片染色 脱蜡 二甲苯I 10min 二甲苯II 10min 二甲苯III 10min 水化 100%酒精 10min 100%酒精 10min 95%酒精 10min 95%酒精 10min 90%酒精 10min 85%酒精 10min 80%酒精 10min 70%酒精 10min 蒸馏水洗 5min*3 抗原修复 抗原修复液： 柠檬酸(0.01mol/L,PH6.0)：柠檬酸钠3g，柠檬酸0.4g，用蒸馏水定容至1000mL EDTA：（PH9.0）：Tri碱1.21g/L，EDTA0.372g/L，蒸馏水定容至1000mL 组化用的缓冲液PBS配置：40g氯化钠+250mL PB原液，定容至5L 修复方法：常采用微波炉修复 微波修复时间：不同的抗体多少有变动。中低火15min（晾凉20min）+低火5min，逐渐恢复至室温 阻断内源性过氧化物酶 加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10分钟；PBS缓冲液冲洗3分钟×3次。 滴加封闭液 滴加100μL或适量的封闭液（正常山羊血清工作液），室温孵育30min-90min，勿洗。 滴加一抗 根据组织大小，滴加适量的一抗，4℃孵育过夜 滴加二抗 样本恢复至室温后，滴加100μL或适量的生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，即二抗，37°C保温湿盒30min；PBS缓冲液冲洗5分钟×3次。 显色 加入适量新鲜配制的DAB显色液（20×=1:20稀释），室温孵育5～8分钟，显微镜下观察，时间很灵活，用蒸馏水终止显色更好。 复染 蒸馏水冲洗，苏木素染色液染1min，时间灵活；分化、冲洗返蓝。 脱水 75%，80%，85%