凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量.pptx

实验三 凝胶过滤层析法 测定蛋白质分子量 ;【目的要求】; 【原理】;相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。 中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。;图3 -1 凝胶层析分离原理示意图 ;【基本概念】;【基本概念】;; 洗脱体积的测定;分配系数?表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。; 对于完全排阻的大分子 Ve ＝ Vo 故 Kav ＝ 0 对于完全渗透的小分子 Ve ＝ Vt 故 Kav ＝ 1 Kav是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋白质分子质量的一个依据。 对于某一型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，各个组分的Kav与其分子质量的对数成线性关系： Kav ＝ －blgMr+c 由于Ve 和Kav也成线性关系所以同样有： Ve ＝ －b’lgMr+c’ ; 通过将一些已知分子质量的标准蛋白质在同一凝胶柱上以相同条件进行洗脱，分别测定Ve 或Kav，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后在相同条件下测定未知样品的Ve 或Kav，通过标准曲线即可求出其分子质量。 ;　吸水率和床体积??;【应用】;【操作方法】; 3）向柱内加入约1/4柱体积的洗脱液，将浓浆状的凝胶缓慢地倾入柱中，使之自然沉降，凝胶沉降约2～3㎝高度后打开出水口，待胶面上升到柱记号处时则装柱完毕。然后关闭出水口，静置片刻，等完全沉降，将接接口的乳胶管与盛有洗脱液的储液瓶连接，调流速3～6mL/10min，用 2～3倍柱床体积的洗脱液平衡。;三、Vo 的测定; ; 五、未知样品蛋白质分子量的测定;样品; 结果分析;