动物生物技术第六章转基因动物.ppt

五、动物生物反应器存在的问题与发展前景 构建动物生物反应器成功率低 造成宿主基因突变问题 外源基因表达水平不高 逆转录病毒转染法研究中存在问题 正负筛选法的基本方法是：构建一种特殊的载体，该载体含有一段与靶基因同源的序列，在这段序列的某一外显子中插入Ncor基因作为正选择标记；在同循序列之外的3’末端，或3’，5’两个末端接上单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶（HSV-tk）基因的序列作为负筛选标记。经酶切后使其线性化，然后用电脉冲转染法导入细胞中，继续体外培养，并以药物G?-418和GANC作双重筛选。如果所导入的重组?DNA与受体细胞基因组DNA之间发生非同源重组，则外源基因通常是从头至尾均整合入受体细胞基因组中，故其基因组中含有外源的基因（Neor，?HSV-tk），此时的Neor和HSV-tk基因同时表达，其中Neor的基因产物使细胞具有G-418抗性，而HSV-tk基因的产物则将GANC磷酸化产生对细胞有毒性的物质，使细胞死亡。若为同源重组，外源目的基因及Neor基因会整合到受体细胞基因组同源序列的座位上，而位于同源序列外端的?HSV-tk基因则在重组后丢失，因而此时仅有?Neor表达，受体细胞同时具有G-418及GANC双重抗性而在选择培养基中存活下来。Mansour和?Capecchi采用此方法，已完成ES细胞?Hprt，int-?2，hox1.2，hox1.3等基因的定点突变。 * * * * * 在哺乳动物转基因过程中，外源基因在基因组中的定位，有利于分析阳性克隆细胞或生物体的基因功能及其生物学效应。然而，piggyBac转座子在转座酶的辅助下，特异性识别基因组中位点5-TTAA-3，并且在随机插入基因组的过程中，更倾向于插入基因的5非翻译区［5］。外源基因插入宿主基因组的非编码区，使外源基因在体内得到表达，与同源重组相比，piggyBac转座子更有利于转基因哺乳动物的产生。piggyBac转座子在剪切和粘贴的过程中，会越过DNA的合成，而不影响到DNA的修复或复制。piggyBac转座子上的DNA发生甲基化时，其转座被抑制。在老鼠的胚胎肝细胞中，piggyBac转座子跳跃的频率比较高，载体系统在转染细胞后，通过反向PCR和Southernblot技术，在一些阳性克隆细胞中，可以检测到15个以上的拷贝数［4］。此外，piggy-Bac转座子倾向于在局部范围(≈100kb)内跳跃。 * 尽管转基因动物的研究仍面临着许多需要解决的问题，但它潜在的社会价值是无可估量的。在未来几年内，将有多种动物生物反应器重组蛋白上市，从而形成市场前景广阔和利润巨大的新生物制药行业。 * 外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区 * 增强抗病性 ◆ 如：美国和日本的研究人员通过转基因技术培育出一种不产生朊蛋白的牛胚胎 ◆ 方法： 首先从牛体细胞内提取了产生朊蛋白的基因序列，随后用一个人造脱氧核糖核酸(DNA)片段插入该基因序列，阻止基因发挥正常功能，然后将这段经过改造的基因序列重新注入牛体细胞内，再通过克隆技术培育出牛胚胎 缺点 ①获得转基因牛比其它转基因动物更加困难：微分干涉相差显微镜难以分辨猪、牛等的精前核，需进行进一步超速离心才能分辨出 ②从受精卵发育成小牛差不多要花两年的时间，且牛的每胎产仔数很少，进一步提高了成本 2、转基因羊 主要集中在利用其乳腺作为生物 反应器生产药物蛋白 ①构建用乳腺特异性启动子驱动的编码人类基因的载体，得到转基因绵羊和山羊，能将表达的人类蛋白质分泌到乳汁中，所表达的蛋白质是经过的糖化的，理论上同从人体提取的蛋白质一样具有生物活性 ②已在转基因羊的乳汁中成功的表达了凝血因子IX、白细胞介素2、尿激酶等多种药物蛋白 β乳球蛋白启动子 ATT 显微注射 绵羊卵细胞 母绵羊 纯合转基因绵羊 PCR 方法检测 收集转基因羊乳 ATT只在乳腺组织中表达 分离羊乳中的蛋白质 纯的ATT（抗胰蛋白酶） 羊乳中含有ATT 在绵羊奶中生产ATT 3、转基因猪 ①以转化人的血红蛋白基因最为成功： 将人的β珠蛋白基因的调控区域与两个人α1珠蛋白，一个人βa珠蛋白基因相连接，构建载体，得到的转基因猪在血液中表达了人的血红蛋白 人们根据各种化学标准检测发现，它们与天然的人的血红蛋白性质完全相同 利用转基因动物生产的人血红蛋白来辅助输血 ②异种器官移植 会产生强烈的排异反应：有相当一部分是由于仅发生于非灵长类哺乳动物中的蛋白糖基化修饰造成的 在猪、牛等动物中，糖基化修饰的最后步骤是在α－1，3－半乳糖基转移酶的作用下，在糖链的末端加两个半乳糖基，而这种修饰在人细胞中根本不存在，所以在器官移植后会产生针对这种糖基化修饰的超急性和急性排异作用 超急性排异反应：完全针对糖链末端的α－