临床检验仪器学-—PCR核酸扩增仪.ppt

微量样品无限分液 数字PCR仪 微流控芯片法 微滴法(油包水PCR) CONTENTS 01 PCR技术原理 02 PCR仪的工作原理及分类 03 PCR仪的性能、操作与维护 04 PCR仪的临床应用 目录 检测BCR-ABL1融合基因拷贝数 问题：如何选择PCR仪？ 性能 指标 温度 控制 荧光 检测 其他 功能 温度的 准确性 热盖 温度 不同模 式下的 相同温 度特性 升降温 的速度 温度的 均一性 CT值 重复性 误差 检测 通道 数量 荧光 检测 范围 基座 容量和 样品数 软件 功能 一、性能评估 性能 指标 温度 控制 荧光 检测 其他 功能 温度的 准确性 热盖 温度 不同模 式下的 相同温 度特性 升降温 的速度 温度的 均一性 CT值 重复性 误差 检测 通道 数量 荧光 检测 范围 基座 容量和 样品数 软件 功能 温度控制 荧光性能 第十三章PCR核酸扩增仪 胡昌明 2017年12月20日 PCR是一种基因检测技术 实现PCR技术 的仪器 PCR产物检测 可以是PCR仪器的自身功能 也可以用其它仪器进行检测 CONTENTS 01 PCR技术 02 PCR仪的工作原理及分类 03 PCR仪的性能、操作与维护 04 PCR仪的临床应用 目录 Kary B. Mullis 1983年，在一个春天的晚上，心烦意乱的Mullis和他的女朋友驱车前往乡间的小屋度假 窗外是一片片绿油油的麦田，Mullis无心欣赏路上生机勃勃的景色，他的心里一直思索着要怎么提高核苷酸合成的效率 汽车不断的前进着，轮胎压过路面，留下清晰的印记，路上安静得只能听到车轮旋转和发动机的声音 “车轮旋转，对了，就是车轮旋转！” 于1983年由美国Cetus公司的K.Mullis建立，获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增。模拟细胞内复制过程，于体外试管里建立反应，经过数小时之后，就能将极微量的目的基因或者某一特定的DNA片段放大千百万倍 聚合酶链式反应(PCR) 一、模拟细胞内复制过程 半保留复制 连接酶、解旋酶、启动酶、DNA结合蛋白、聚合酶、Mg2+、dNTP 模板DNA　 二、准确的温度控制 变性与复性 30次循环后靶序列扩增的数量 循环数 扩增产物量 （2n） 1 21＝2 2 22＝4 3 23＝8 4 24＝16 5 25＝32 6 26＝64 20 220＝1,048,576 30 230＝1,073,741,824 PCR技术的关键要素 模拟的体内环境： 酶、Mg2+、dNTP 引物、模板　 变性退火延伸过程中的温度控制和时间控制 变性温度一般93℃，时间不等 退火温度和时间 延伸，一般为72℃，时间根据扩增区域片段大小变化 PCR仪 PCR技术的仪器 CONTENTS 01 PCR技术原理 02 PCR仪的工作原理及分类 03 PCR仪的性能、操作与维护 04 PCR仪的临床应用 目录 温度对PCR的影响 思考： 温度控制的要求是什么？ 温度控制的基本要求 1、准确性(不能存在Overshooting和Undershooting现象) 2、均一性(尽量不能存在边缘效应) 3、升降温的速度(要在短时间内达到需要的温度) 4、防蒸发等 控温方式 水浴锅控温 压缩机控温 半导体控温 离心式空气 加热控温 一、水浴PCR仪 1、准确性高 2、均一性好 3、升降温的速度快 4、PCR体系需要加甘油等防蒸发 5、通量大 二、压缩机控温PCR 基本被淘汰 三、半导体PCR仪 1、准确性较好(误差0.3内) 2、均一性较差(0.5内) 3、升降温的速度快（2~5） 4、顶盖高温防蒸发，操作方便 5、通量较大(48,96,384) 四、空气加热离心式PCR仪 1、准确性较差(误差0.5内) 2、均一性较好(0.1内) 3、升降温的速度快（5） 4、离心防蒸发，但加术不方便，操作不方便 5、通量较小(32,72) PCR仪的其它功能 1 梯度 PCR仪的其它功能 2 原位 PCR仪的其它功能 3 产物检测 定性 PCR仪 荧光定量PCR仪 数字PCR仪 实时荧光PCR仪 染料法 探针法 目的基因报告荧光 报告荧光 收集荧光 思考： 实时荧光PCR的加热模式可能是什么？ 分类 2、金属板式 1、离心式 各孔独立控温的荧光定量PCR仪