生物化学-第2章-蛋白质（1）-CPL.ppt

一级结构：氨基酸序列、二硫键的变化等 核糖核酸酶的变构 牛引产素与牛加压素 分子病：镰刀型红细胞贫血病 胰岛素原的激活 空间结构与功能： 肌红蛋白与血红蛋白/二者与氧结合能力 血红蛋白的变构现象 协同效应 蛋白质结构与功能的关系 加热变性沉淀反应：疏水基团暴露 不可逆 变性 变性 疏水基团 重金属盐沉淀反应 ：蛋白质阴离子与铜、汞、　 　 银等结合为不溶性蛋白盐而沉淀。 应用：重金属盐中毒解毒 立即服用大量鲜牛奶或蛋清和豆浆 生物碱试剂的沉淀反应 ：蛋白质在pH pI 时带正电荷, 与苦味酸、磷钨酸、鞣酸等结合沉淀。 酸类沉淀：三氯醋酸、鞣酸等与蛋白质正电荷等结合沉淀。 + 蛋白质 – 生物碱 或酸类 + + 沉淀 5. 蛋白质的紫外吸收及呈色反应 紫外吸收：蛋白质中的Tyr、Trp和Phe残基在近紫外区有光吸收，使蛋白质在280nm有最大光吸收，这一特征可用于蛋白质的定量检测。 呈色反应：蛋白质分子结构中的自由 –NH2、COOH 和肽键，以及某些氨基酸的侧链基团，能够与某种化学试剂发生反应，产生有色物质。 反应名称 试 剂 颜 色 反应有关基团 有此反应的蛋白质或氨基酸 双缩脲反应 （检测肽键） NaOH、CuSO4 蓝紫色 二个以上肽键 所有蛋白质 米伦反应 HgNO2、HgNO3及HNO3混合物 红色 ? Tyr 黄色反应 浓HNO3及NH3 黄色 ? Tyr、Phe、Trp 乙醛酸反应 乙醛酸试剂及浓H2SO4 紫色 ? Trp 坂口反应 α-萘酚、NaClO 红色 胍基 Arg 酚试剂反应 (Folin反应) 碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸 蓝色 酚基、吲哚基 Tyr 茚三酮反应 茚三酮 蓝紫色 自由氨基及羧基 α-氨基酸 N 蛋白质的颜色反应 OH 蛋白质含量测定方法 定氮法 双缩脲法 Folin-酚试剂法（Lowry method） 紫外吸收法 考马氏亮蓝法 （Bradford assay） BCA法 经典 方法 新的方法 第5节 蛋白质的分离纯化和测定 蛋白质分离的一般程序： 前处理、粗分级和细分级。 前处理：首先把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，生物活性。 组织细胞破碎 + 蛋白抽提 1. 蛋白质的分离纯化及分子量的测定 常用的破碎组织细胞的方法： 机械破碎法（电动捣碎机，匀浆器） 渗透破碎法（甘油或蔗糖溶液） 反复冻融法（细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破） 超声波破碎法（使细胞膜上所受张力不均而破壁） 酶法（溶菌酶等） 蛋白质的抽提： 抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择，应根据欲制备的蛋白质的性质而定。 膜蛋白抽提：加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠，triton X-100)，使膜结构破坏，使蛋白质与膜分离。 粗分级：当提取蛋白质混合物后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白质分离开来。 等电点沉淀法 + 盐析 + 有机溶剂沉淀 等电点沉淀法 调节蛋白质溶液的pH值，使目的蛋白质到达等电点而沉淀。 盐析法 　 　盐溶：低浓度的中性盐使蛋白质溶解度增加而溶解。由于蛋白质分子吸附盐的离子后，改变了原有蛋白质分子上侧链的电离趋势。 　 盐析：高浓度盐类（硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等）可使蛋白质分子脱去水化层或表面电荷被中和，导致蛋白质沉淀。 被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性，是利用半透膜分离蛋白质的常用方法。 蛋白质的盐析 有机溶剂沉淀法： 中性有机溶剂如乙醇、丙醇，介电常数比水低。可增加相反电荷之间的吸引力，并能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，从溶液中沉淀出来。 由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 细分级：样品经粗分级以后，一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等进一步提纯，得到有一定纯度的样品。必要时还可选择电泳法。 按蛋白质分子大小不同的分离 a. 透析与超滤 b. 密度梯度离心法 c. 凝胶过滤法--分子筛分