分子生物实验四 PCR-RFLP基因分型实验-任竹青.ppt

实验四 PCR-RFLP基因分型实验 动科-动医学院 徐德全、郑嵘、任竹青 内容 CONTENTS 01 实验目的 02 实验原理 03 实验仪器与试剂 04 实验步骤 05 结果与分析 06 07 实验结果处理 思考题 一、实验目的 1.熟悉PCR-RFLP分析技术原理及实验步骤； 2.掌握限制性核酸内切酶消化DNA的原理； 3.了解PCR-RFLP分析技术在畜禽基因分型中的作用。 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymophism，RFLP): 是指由限制性酶切位点间的插入、缺失、重排或点突变所引起的基因型间限制性片段长度的变异。 二、实验原理 什么是限制性内切酶？ 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，是可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。 EcoRI特异性识别位点： 每种限制酶只能识别一种特异的核苷酸序列 如果酶切位点碱基发生变化，酶切位点将消失或增加 内切酶识别位点 单个碱基突变位点 聚合酶链式反应—限制性片段长度多态（PCR-RFLP）分析技术是在PCR技术基础上发展起来的。 指DNA碱基置换正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，利用这一酶切性质的改变，PCR特异扩增包含碱基置换的这段DNA，经某一限制酶切割，再利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，与正常比较来确定是否变异（重点）。 如何寻找DNA序列中的限制酶识别位点？ Webcutter 2.0软件 网址: http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/ PCR-RFLP实验原理示意图（重点） Allel1 Allel2 突变位点 primer1 primer2 primer1 primer2 PCR 酶切 含有限制性酶切位点 + 电泳 等位基因分型示例 野生型（AA），杂合子(Aa)，纯合子(aa) 对应三种电泳带型： AA Aa aa PCR-RFLP技术的用途 可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析，间接进行基因诊断或分子标记辅助育种。 黑素皮质素受体-4（melanocortin-4 receptor，MC4R）是下丘脑腹内侧核分泌的一类肽类物质，为黑素皮质素受体家族5 个亚型（MC1-5R）之一。 在哺乳动物中，MC4R 具有介导瘦蛋白（leptin）的功能，是一个调节能量平衡与能量动态平衡的重要信号分子。 与背膘厚相关，分子标记。 猪MC4R基因 猪MC4R基因包括1个外显子, 编码332个氨基酸,突变发生位置在第298位天冬酰胺(Asn)代替天冬氨酸(Asp)的错义突变(Asp298Asn)。 猪MC4R基因 猪MC4R基因 FastDigest? TaqI 识别序列 M表示Maker；泳道1、2、3为AG基因型；泳道4为 GG基因型；泳道5、6、7为AA基因型 三、实验仪器与试剂 1．限制性内切酶、10×酶切缓冲液。 2．2%的琼脂糖凝胶、5×TAE、6×上样缓冲液、DNA Marker、Ultra GelRed。 3. 恒温水浴箱、琼脂糖凝胶电泳装置、封口膜、浮漂、微波炉、250ml三角烧瓶、托盘天平、台式高速离心机。 四、实验步骤 限制性酶切 酶切体系： PCR纯化产物 10 μL Taq I 1 μL Buffer H 2 μL ddH2O 7 μL Total 20 μL PCR产物 限制性酶切 电泳检测 实验步骤： 1. 制备酶切体系 2. 盖紧离心管盖子，在振荡器上充分混匀2s，立即于 离心机内离心一下，将管壁上的液体集中于管底； 3. 将离心管置于65 oC水浴锅中反应30min； 4. 在酶切反应的同时，制备2%的琼脂糖凝胶； 5. 电泳； 6. 紫外投射仪观察结果。 五、结果与分析 根据电泳结果分析酶切图谱 提交“PCR实验”实验报告（统一格式、纸张） 六、实验结果处理 PCR-RFLP技术原理？ 七、思考题