分子生物实验五 质粒提取与浓度测定.ppt

5. 向离心管中加入350 μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000 rpm (~13,400×g )离心10 min。 注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。 6. 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中 （吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000 rpm (~13,400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。 7. 可选步骤：向吸附柱CP3中加入500 μl去蛋白液PD，12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。 如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21， HB101，JM系列， ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。 如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），这步可省略。 8. 向吸附柱CP3中加入600 μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。 9. 重复操作步骤8。 10. 将吸附柱CP3放入收集管中, 12,000 rpm (~13,400×g) 离心2 min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。 注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 11. 将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100 μl洗脱缓冲液EB，室温放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g) 离心2 min将质粒溶液收集到离心管中。 注意：洗脱缓冲液体积不应少于50 μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。 若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。 为了增加质粒的回收率，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2 min，12,000 rpm(~13,400×g) 离心2 min，将质粒溶液收集到离心管中。 注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。 1．溶液P1在使用前先加入RNase A（将试剂盒中提供的RNase A全部加入），混匀，置于2-8℃保存。 2．使用前请先检查平衡液BL、溶液P2和P3是否出现浑浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。 3．注意不要直接接触溶液P2和P3，使用后应立即盖紧盖子。 4．所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心，速度为12,000 rpm(~13,400×g )。 5．提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。 6．实验前使用平衡液BL处理吸附柱，可以最大限度激活硅基质膜，提高得率。 7．用平衡液BL处理过的柱子最好当天使用，放置时间过长会影响效果。 8．去蛋白液PD可以有效去除残留的蛋白污染，当宿主菌为endA+（TG1、BL21、HB101、ET12567、JM系列）等核酸酶含量较高的菌株时，强烈推荐使用去蛋白液PD。 (二)测定DNA浓度与纯度 利用紫外可见分光光度计分别测定在波长260nm处、280nm处DNA的吸光率，然后计算其浓度与纯度。 注：对于纯的核酸溶液，测定A260，即可利用核酸的比吸光系数计算溶液中核酸的量。核酸的比吸光系数是指浓度为1μg/ml的核酸水溶液在260nm处的吸光率，天然状态的双链DNA的比吸光系数为0.020，变性DNA（即单链DNA）和RNA的比吸光系数均采用0.022。 DNA纯度可以A260/A280的比值表示：纯的DNA样品比值为1.8，纯的RNA样品比值为2.0。核酸样品中若含有蛋白质或苯酚等杂质，此比值则显著降低。 （三）利用琼脂糖凝胶电泳检测质粒 琼脂糖凝胶电泳技术是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。凝胶分辨率决定于使用材料的浓度，并由此决定凝胶的孔径。琼脂糖凝胶可分辨0.1~6.0 kb的双链DNA片段。 1%的琼脂糖凝胶 超螺旋 环状 线性 五、结果与分析 * 实验五 质粒提取与浓度测定 任课教师：徐德全、郑嵘、任竹青 renzq@mail.hzau.edu.cn 动科-动医学院 内容 CONTENTS 01 实验目的 02 实验原理 03 实验仪器与试剂 04 实验步骤 05 结果与分析 一、实验目