临床免疫学—单个核细胞的分离.ppt

单个核细胞的分离与活性鉴定 临床免疫学检验教研室 实验目的 掌握外周血单个核细胞分离操作基本步骤、注意事项； 了解分离免疫细胞的常用方法。 实验原理 各种血细胞的体积、形态、密度不同； 红细胞和粒细胞的密度较大，为1.092左右；淋巴细胞和单核细胞的密度为1.075～1.090；血小板为1.030～1.035。利用一种密度介于1.076～1.090之间、近于等渗的聚蔗糖-泛影葡胺进行密度梯度离心，从而分离不同类别的血细胞； 台盼蓝染色原理 试剂和器材 1. 淋巴细胞分离液； 2. 标本肝素抗凝外周血； 3. 生理盐水； 4. 0.5%台盼蓝染液 5. 离心机； 6. 显微镜； 7. 试管、玻片 实验步骤 1. 先取2ml淋巴细胞分离液于离心管中； 2. 另取一干净试管，依次加入2ml生理盐水和2ml外周血， 并 混匀； 3. 沿管壁缓慢将稀释外周血叠加到淋巴细胞分离液上； 4. 配平后，离心2500rpm，20min； 5. 小心吸出云雾层，移入另一试管； 6. 加入2~4X体积生理盐水，混匀，2000rpm离心10min, 弃上清； 7. 将细胞重悬，加等体积台盼蓝染液混匀，静置5min后，镜下计数200个细胞，计算活细胞率。 结果判断及分析 1. 活细胞折光性强，胞膜光滑，对染料排斥，拒染； 2. 死细胞胞膜不完整，通透性增加，镜下可见被染成蓝色； 活细胞率=活细胞数/总细胞数X100% 注意事项 1. 全程操作动作要轻，防止机械损伤； 2. 淋巴分离液直接加入管底，避免浸沾管 壁； 3. 加样顺序，切勿颠倒； 4. 离心前要配平，第一次离心时，要调至自然降速； 5. 收集目的细胞时，尽量避免吸入分离液。 方法学评价 操作简单，成本低，基本能够满足临床和科研需要； 纯度不够。 思考题 1. 现分离得到4ml单个核细胞悬液，镜下用细胞计数板计数周围4大格， 计数结果为600， 现欲将其浓度调整为1X106/ml, 应如何校正？ 离心前 离心后