临床免疫学—免疫实验.docx

免疫实验 操作题——乙肝两对半的检测： 原理： HBsAg：双抗体夹心法（两步法：消除钩状效应） 将抗HBs包被在固相载体上，加待测标本，经孵育后洗涤，加入酶标抗HBs，形成固相载体-抗HBs-HBsAg-酶标抗HBs免疫复合物。加底物后，复合物中的酶将底物催化成为有色产物，根据颜色的深浅进行HBsAg的定性或定量。 HBsAb：双抗原夹心法 将HBsAg包被在固相载体上，加待测标本，经孵育后洗涤，加入酶标HBsAg，形成固相载体-HBsAg-HBsAb-酶标HBsAg免疫复合物。加底物后，复合物中的酶将底物催化成为有色产物，根据颜色的深浅进行HBsAb的定性或定量。 HBeAg：双抗体夹心法 将抗HBe包被在固相载体上，加待测标本，经孵育后洗涤，加入酶标抗HBe，形成固相载体-抗HBe-HBeAg-酶标抗HBe免疫复合物。加底物后，复合物中的酶将底物催化成为有色产物，根据颜色的深浅进行HBeAg的定性或定量。 HBeAb：中和竞争法(待测样本的HBeAb与固相抗体竞争结合中和抗原HBeAg) HBcAb：竞争抑制法 将HBcAg包被在固相载体上，同时加入待测样本和酶标抗HBc，酶标抗HBc与待测样本中的抗HBc竞争结合固相HBcAg，加入酶底物显色，显色的深浅与待测样本中的HBcAb含量呈负相关。 试剂与器材： 试剂盒组成： 1.包被反应条：固相的抗原或抗体 2.酶结合物：酶标记的抗原或抗体 3.显色剂：分A、B二瓶 4.终止液 5.对照：阳性对照，阴性对照 6.浓缩洗涤液（配制洗涤液：用蒸馏水按1：20稀释浓缩洗涤液） 7.中和试剂（只有检测HBeAb的试剂盒才有） 操作步骤： 1、加样：第一、二孔为阴、阳对照孔，分别加入阴、阳对照50ul。其余各孔为样品孔，各加入待测标本50ul（检测HBcAb 时，待测标本需用稀释后的洗涤液做1：30稀释）。 2、加中和试剂（只有检测HBeAb时才需要）：每孔50ul 3、加酶结合物：每孔50ul 4、温育：封板→充分混匀后置37°C水浴30分钟 5、洗涤：弃去反应条孔内液体，用洗涤液注满每孔，放置或振荡1分钟，弃去拍干→反复5次（注意：最后一次一定要拍干） 6、显色：每孔先加显色剂A 50ul，再加显色剂B 50ul，混匀后置37°C水浴10分钟 7、中止显色：每孔加入中止液50ul 8、判断结果 注意事项： 标本：内源性和外源性因素 试剂：试剂质量、批号、是否失效、平衡、摇匀 加样：不可太快，避免加在上部和产生气泡。 加试剂时不可重复加和漏加，或加在两孔之间。 温育：温度、时间、湿度、封片 洗板：手工或仪器 比色：建议双波长比色。 结果判定：反应终止后10分钟内 质量控制：内对照、室内质控、室间质评等 表面抗原阳性结果建议复查；灰区标本和矛盾结果建议复查 试剂盒应视为有传染性物质。 结果分析与判断： ①目测法： HBsAg， HBsAb， HBeAg：透明无色—阴性，黄色—阳性 HBeAb ， HBcAb：透明无色—阳性，黄色—阴性 ②比色法：波长450nm读取各孔OD值，阳性如下： HBsAg， HBsAb， HBeAg 样品OD值/阴性对照OD值≥2.1 HBeAb ， HBcAb 阴性对照OD值/样品OD值≥2.1 （建议双波长比色（450/630nm） 临床意义： 模式? HBsAg? HBsAb? HBeAg? HBeAb? HBcAb? 临床意义? 1 + - + - + ①急性乙肝?②慢性乙肝?③病毒复制活跃，传染性强? 2 + - - - + ①急性HBV感染②慢性HBsAg携带者③传染性弱? 3 + - - + + ①急性HBV感染趋向恢复②?慢性HBsAg携带者③传染性弱? 4 - - - + + ①既往感染过HBV?②急性HBV感染恢复期? 5 - - - - + ①既往感染过?HBV?②急性?HBV?感染窗口期 6 - + - + + ①急性感染后康复,?有免疫力?? 7 - + - - + ①乙肝恢复期，已有免疫力? 8 - + - - - ①注射乙肝疫苗?②?HBV?感染后已康复，有免疫力 理论题： 免疫浊度法测免疫球蛋白： 属于液相沉淀反应;　 抗原抗体在合适缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度,从而引起反应体系吸光度的改变。当反应液中保持抗体过量时，形成的复合物随抗原量增加而增加，反应液的浊度亦随之增加，与一系列的标准品对照，即可计算出待测抗原的含量。 双向免疫扩散试验： 本质上属于固相免疫沉淀反应； 可溶性抗原和抗体分别在含有电解质的固相介质中向四周扩散, 若抗体抗原相对应, 则在比例适宜处形成沉淀线； 若将待检抗体做系列倍比稀释，可以根据白色沉淀线逐渐消