临床免疫学—酶免疫技术.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * 间接法 方法 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。 优点 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体 应用 常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定 ELISA检测抗体的方法 间接法检测抗原原理示意图 间接法的特点 只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体(酶标抗人IgG)建立检测相应抗体的方法。 易受血清中高浓度非特异性IgG的干扰，待测标本需稀释后测定。 双抗原夹心法 原理：类似双抗体夹心法 操作步骤：类似 应用：乙型肝炎表面抗体 ELISA检测抗体的方法 捕获法 原理： 抗人IgMμ链抗体包被 捕获待测标本中IgM类抗体 加入特异性抗原和酶标记针对特异性抗原的抗体 底物显色 捕获法检测IgM时RF干扰 固相载体 抗IgM RF（IgM型） 标记抗体（IgG) 特异性Ag 假阳性 确定最佳工作浓度：对包被抗体（抗原）和酶标记物进行最佳工作浓度滴定和选择。 包被技术：将抗体（抗原）与固相载体连接的过程称为包被（coating) 二、技术要点 要求 结合抗体或抗原的容量大 抗体或抗原牢固地固定在其表面 不影响免疫反应性 利于反应充分进行 固相方法简便易行，快速经济 种类 聚苯乙烯塑料 磁性微球 膜载体 固相载体 直接包被：pH9.6碳酸盐溶液，4℃过夜 用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清再包被一次，以消除固相载体表面未结合的位点，此过程为封闭。 包被coating 封闭blocking 包被与封闭 确定最佳工作浓度 选择强阳性参考血清OD值为0.8左右，阴性参考血清OD值0.1，P/N最大值的包被抗原稀释度为工作浓度。如表中包被抗原最适浓度为1:200 以强阳性抗原OD值在0.8左右，阴性参考OD值0.1为最适条件，可知包被抗体和酶标抗体的最佳工作浓度分别为1mg/L和1:5000 斑点酶免疫印迹试验原理示意图 酶联免疫斑点试验原理示意图 酶桥法检测原理示意图 过氧化物酶-抗过氧化物酶法检测原理示意图 1．酶免疫技术的要点？ 2．酶联免疫吸附试验的原理（ELISA）？ 3．竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？ 4．常用的底物有哪几类？特点？ 5．常用的酶有哪几类？特点？ 6．何谓包被与封闭？其作用？ 7．常用固相载体的种类和特点？ 8．举例固相酶免疫测定应用的原理及影响因素。 9．ELISA的常见的分析模式有哪些？ 思考题 酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底物的作用进一步提高敏感性。酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两大类,后者根据抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型。 均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原的测定，非均相酶免疫测定根据是否使用固相支持物，又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。最常用的是以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）,其原理可以有夹心法、竞争法、间接法和捕获法等。 小 结 * * * * * * * * * * * * * * 酶免疫技术广州医科大学金域检验学院 徐霞 主要试剂: 酶标记的抗体或抗原 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性 抗原抗体反应的特异性 + 酶高效催化反应的专一性 原理及特点 酶免疫技术 酶免疫组化 酶免疫测定 均 相 非均相 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定 组织切片或其它标本中抗原的定位 液体标本中抗原或 抗体的定性和定量 用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。 原理 一、均相酶免疫测定 分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定 以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA） 是目前最为常用的固相酶免疫测定 与均相不同之处 需分离游离与结合的酶标记物 二、非均相酶免疫测定 特点： 灵敏度高 操作简便 安全、环保 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的新方法。 对抗体（抗原）分子天然构象有一定影响 原理： 酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应 酶对底物的显色反应 对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析 原理及特点 标记酶的要求： 活性高 性质稳定 专一性强