临床免疫学—凝集反应 沉淀反应(2015检技).ppt

1、什么是凝集试验？什么是沉淀反应？ 2、简述直接凝集试验的定义、分类及临床应用。 3、什么是间接凝集试验？可以分为哪几种类型？各类型的原理分别是什么？ 4、简述抗人球蛋白试验的原理、类型及其在临床上的应用。 5、简述单向免疫扩散试验的基本原理。 6、双向免疫扩散试验的应用有哪些？ 6、简述免疫电泳和免疫固定电泳的原理及临床应用。 思考题 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 直接法 临床意义：常用于新生儿溶血症、自身免疫性溶血性贫血、获得性溶血性贫血等的检测。 RBC为Rh+ 7S的IgG 体内发生 + 抗IgG 体外测试 抽血 * 间接法 临床意义：多用于检测母体 Rh(D)抗体，以便及早发现及避免新生儿溶血症的发生。亦可用于输血前不规则抗体的筛查。 RBC为Rh+ 血清不完全抗体 + 抗IgG 体外测试 * 凝集试验的类型 直接凝集试验 间接凝集试验 玻片凝集试验 试管凝集试验 （正向）间接凝集试验 反向间接凝集试验 间接凝集抑制试验 反向间接凝集抑制试验 血凝试验 胶乳凝集试验 协同凝集试验 抗人球蛋白试验 直接抗人球蛋白试验 间接抗人球蛋白试验 * 沉淀反应 Precipitation * 学习目标 【掌握】 1、沉淀反应的概念。 2、免疫扩散试验的基本类型和原理。 3、免疫固定电泳技术的检测原理。 【熟悉】 1、对流免疫电泳、免疫电泳的原理。 2、免疫固定电泳的临床应用和双向免疫扩散的实 际应用。 【了解】单向免疫扩散、对流电泳和免疫电泳的应用。 * 　沉淀反应（precipitation）是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合产生可见沉淀物的现象。 沉淀反应的概念 * 絮状沉淀试验免疫浊度测定 单向免疫扩散试验 双向免疫扩散试验 对流免疫电泳 火箭免疫电泳 免疫电泳 免疫固定电泳 液相沉淀反应 凝胶内沉淀反应 凝胶免疫电泳技术 沉淀反应 * 原理：将一定量的抗体混入琼脂糖凝胶中，让待测抗原在凝胶中自由扩散,在两者比例合适的部位结合形成沉淀环。环的大小与抗原的浓度成正相关。 一、单向免疫扩散试验 * 倾注平板　打孔　加样　 放置37℃　24～48h观察沉淀环 单向免疫扩散试验（平板法） * Mancini曲线： 大分子抗原（IgM） 　时间扩散＞48h， 常数K＝C∕d2 C为抗原浓度， d为沉淀环直径 抗原含量两种计算方法 T1为16～24h；T2为24～48h；T3为48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物线 Fahey曲线： 小分子抗原(IgG,IgA) 扩散时间24h 　常数K＝logC∕d 　 t1为16～24h；t2为24～48h；t3为48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线 * 抗体质量 标准曲线 质控血清 双环现象 　不同扩散率抗原性相同的两个组分 影响因素 * 原理：将抗原和抗体分别加在琼脂糖凝胶的对应孔中，两者在凝胶中向对方自由扩散，在比例合适处形成白色沉淀线。 鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一 二、双向免疫扩散试验 * 用生理盐水配制1.5%琼脂糖，微波炉将其加热、融化 技术要点 * 俯视图 侧面图 冷却至50℃左右，将琼脂糖溶液平铺在载玻片上，厚2-3mm * 打孔 5μl抗原加入中央孔 不同稀释倍数的抗体5μl加入周围孔 * 置湿盒中37℃过夜 湿盒 恒温箱 * 实验结果 * 1.抗体效价的滴定 以出现沉淀线的最高抗体稀释倍数为该抗体的效价或滴度。 应用 * 2.抗原或抗体相对浓度和分子量的初步分析 应用 二者分子量大致相等，沉淀线呈直线；分子量大扩散慢，扩散圈小，沉淀线弯向分子量大的一方 * 3.抗原性质的分析 应用 * 电泳分析 ＋ 沉淀反应 抗原抗体反应的高度特异性 电泳技术的高分辨率、快速、微量 免疫电泳技术 * 原理：双向扩散 + 电泳 一、对流免疫电泳 通电 － 蛋白质抗原常带较强的负电荷，在电场中向正极移动 抗体球蛋白 带负电荷较少，籍电渗作用向负极泳动 ＋ * 用PH8.6的巴比妥缓冲液制备琼脂凝胶板，在其上成对打孔，孔径3mm，孔距6 mm，于阴极侧孔内加抗原，阳性侧孔加抗体，电泳条件3～4mA/cm，30min～1h。 技术要点 * 结果分析： 无沉淀线出现则表明无相应的抗原。 沉淀线位于抗原抗体孔中间，说明两者比例较适合。沉淀线偏向抗原孔一方，表示抗体浓度＞抗原，反之，则是抗体浓度＜抗原浓度。 比双向扩散试验灵敏度提高8～16倍。 对流免疫电泳 * 原理：区带电泳＋双向扩散