临床微生物-—丝状真菌鉴定技术、曲霉菌和二相性真菌.pptx

丝状真菌鉴定技术、曲霉和二相型真菌临床微生物检验教研室吴爱武真菌标本采集工具、种类及处理工具：L-型接种针刮刀等1000-1500瓦的电炉丝做L-型接种针L-型接种针用途真菌标本种类及处理脓液、深层趾（指）间皮屑或活动边缘皮屑: 取材前75%酒精消毒，作KOH涂片，同时种于含氯霉素的沙氏琼脂，置25℃培养2周。甲屑：用细挫或牙科磨钻取病甲与正常甲交界处并且贴近甲床部的甲屑，标本用酒精浸泡，待干燥后种于沙氏（SDA），25℃培养4周，并同时作KOH涂片毛发：取病发（变色，无光泽，弯曲，脆易折断，松动易拔除）15根，75%酒精消毒，3～5根作直接镜检，5～10根种于沙氏琼脂（加氯霉素），划破斜面掩埋，25℃培养2周。 痰：通常 以 无 菌 水漱口后再收集痰液，用L-型接种针挑取脓样或黄色粘稠部分，接种于沙氏（SDA) 斜面或沙氏平板。另外用L-型接种针取绿豆大小标本，10%KOH湿片镜检。尿: 新鲜中段尿或清洁尿，离心2000 x g 10分钟，弃上清并充分混合沉淀物，以无菌吸管取底部沉淀物，取2滴接种于SDA 斜面上，另取一滴10%KOH湿片镜检。 脑脊液：留取3-5ml左右，离心2000 g ，10分钟，弃上清取沉淀并充分混合，以无菌吸管吸取，接种于二支SDA(其培养温度分别为25℃和35℃)，肉汤增菌，并取一滴于载玻片上作墨汁染色 。无菌穿刺液：抗凝，与肝素1：1000，离心2000 xg 10分钟，弃上清并充分混合，以无菌吸管吸取，接种在SDA，肉汤增菌，另取标本1滴湿片镜检或革兰染色。组织：将组织置于无菌培养皿中，以无菌剪刀剪碎，加入少量无菌生理盐水(约为组织之1-2倍)，做成悬液，再以无菌吸管吸取，种入SDA, 取一滴涂片。脓、伤口溃疡：以无菌棉棒沾取标本，涂划于SDA，并涂片。血液、骨髓液：采血量为1-5ml。成人及大小孩抽取5ml血液，婴幼儿抽取1-2ml血液。以无菌技术直接打入真菌 培养瓶中，机器培养42 天。 注：阳性标本涂片2张，一张抗酸染色（消化后染色） ，一张湿片镜检寻找菌丝和孢子常用试剂常用试剂10%-20% KOH 革兰染色液印度墨汁乳酸酚棉兰六胺银染色液荧光白染色液氢氧化钾KOH 可以溶解皮屑、甲屑及毛发等角质层组织,显示标本中的真菌成分。对于组织细胞有一定溶解作用、痰液、尿液也很适用。氢氧化钾 10%氢氧化钾+ 墨汁: 提升菌丝与背景染色差。 10%氢氧化钾+ 二甲亚砜: 加速纤维及组织溶解，适用于甲屑。 10%氢氧化钾+ 甘油: 保持菌丝的形态数天。 优点：直接观察菌体，快速 。 氢氧化钾湿片方法方法：加一滴10％-20%KOH，用L-型接种针，钩取有病理意义、绿豆大小标本于载玻片上，覆上盖玻片。镜检： 先使用100X低倍镜检寻找疑似菌丝和孢子。 再用400X高倍镜观察菌体确认。氢氧化钾湿片镜检皮屑甲屑病发10%KOH消化根据菌丝和孢子的特点鉴别是何种真菌氢氧化钾湿片判读结果阴性：无可疑菌丝和孢子阳性：真菌孢子或菌丝①酵母菌呈圆形或卵圆形的孢子，可出芽或呈假菌丝②丝状真菌呈分枝状的菌丝或关节孢子病发发内菌丝 鳞屑细胞间有菌丝 体癣皮屑内的关节孢子KOH处理标本注意事项 对于皮屑、甲屑、毛发、组织等稍加热时可使标本加速溶解， 当标本太厚时，可以用牙签轻压标本，促进氢氧化钾消化组织革兰染色观察酵母菌效果好所有酵母和菌丝呈革兰阳性(有时菌丝着色不好)适用于生殖道分泌物、痰、BAL、脓、尿沉淀物、粪便 缺点:与10%KOH湿片法相比,阳性率低念珠菌假菌丝及孢子革兰染色×1000倍印度墨汁负染用途：用于隐球菌属荚膜的观察,或其他真菌例如红酵母荚膜的观察。标本：主要用于脑脊液标本中隐球菌镜检还可用于灌洗液、支刷物、痰液中隐球菌的检测（加入生理盐水充分振荡混匀，加墨汁染色）CSF阳性率大约为60%印度墨汁负染操作步骤 以无菌吸管吸取处理过的标本一滴置于玻片上再加一小滴印度墨汁混合均匀 以40度角覆上盖玻片(避免产生气泡) 镜检 使用100X聚焦并筛选 如有疑似透明亮点,须用400X观察其确定型态印度墨汁负染结果判读阴性：整个视野为黑色，未见圆形或椭圆形透明环的细胞阳性：见到圆形或椭圆形透明环的细胞，内含颗粒，胞壁厚隐球菌墨汁负染六胺银染色用途：用于组织标本的真菌检测，特别是肺孢子菌的检查染色原理：铬酸氧化细胞壁中的多聚糖成为乙醛, 乙醛的产生使六亚甲基四胺硝酸银成为金属银.结果：真菌被染成棕至黑色艾滋病患者肺泡灌洗液中肺孢子菌六胺银染色图乳酸酚棉兰用途：用于各种真菌培养物的镜检方法： 在载玻片上滴1滴该染液 挑取培养物涂在载玻片上 染色5-10min,以低倍镜观察，高倍镜或油镜确认。丝状真菌乳酸酚棉兰染色隐球菌棉兰染色（可以看到荚膜）荧光白染色原理：荧光染料能与真菌细胞壁的纤维素和几丁质相连接。结