动物病毒学-实验五 血清中和试验.ppt

实验五 血清中和试验 一、实验目的 了解中和试验的基本原理和几种不同的测定方法，掌握固定病毒—稀释血清法的操作步骤和计算方法及含义。 二、原理 中和抗体与相应的病毒粒子特异性地结合，使后者丧失感染能力。 中和抗体是当病原微生物侵入机体时会产生相应的抗体，能够与病原微生物表面的抗原结合，从而阻止该病原微生物黏附靶细胞受体，防止侵入细胞。 终点法中和试验 三、分类 固定病毒—稀释血清法 固定血清—稀释病毒法 蚀斑减数试验 交叉保护试验 实验动物 主动免疫 被动免疫 攻毒 根据动物的保护情况进行结果的判定 四、用途 1、疫苗免疫原性的评价 2、免疫血清的质量评价 3、测定实验动物血清中是否存在抗体 4、从待检血清中检出抗体，或从病料中检出病毒，从而诊断病毒性传染病 5、病毒分离株的鉴定 6、不同病毒株的抗原关系研究 五、材料 1、细胞悬液1瓶(2-3×105个/ml)、生长液 2、96孔细胞培养板 3、加样器/移液器、吸头 4、200TCID50/0.1mL病毒液（PRV） 5、待检血清、（阴阳性对照血清） 六、固定病毒—稀释血清法 将不同稀释度的血清与固定量的病毒液（50ul 200个TCID50、EID50或LD50/0.1mL病毒液）混合，置适当的条件下感作一定时间以后 再将血清-病毒混合物接种于敏感细胞、鸡胚或实验动物，测定被检血清阻止组织培养细胞、鸡胚或实验动物发生病毒感染的能力及其效价。 以能保护50%组织培养细胞、鸡胚或实验动物不发生病变、感染或死亡的血清最高稀释倍数，作为该血清的50%中和效价（PD50） (1)在96孔板上将不同实验组用记号笔进行标记 （2）每孔加入50μl生长液 每孔加入50μl生长液 (3) A1-A5每孔加入50 μl待检血清（同一份血清），分别倍比稀释至H1-5（一排一排稀释，不用换吸头） (3)将200个TCID50的病毒液十倍稀释至0.2个TCID50，第1-4列每孔加入50 μl 200个TCID50的病毒液，第6-9列分别加入50 μl 200/20/2/0.2 TCID50病毒液，第5、11、12列补加50 μl生长液。 注意：第5、11-12列不加病毒，补加生长液 (4)将培养板放入37℃ 5%CO2培养箱中作用30min-60min (5)感作完成后每孔加入100μl细胞悬液，继续置37℃ 5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果，一般要观察4-5天,按Reed-Muench两氏法或Karber法进行结果计算 每孔加入100μl细胞悬液 七、结果判定 接种PRV后不同时间的PK-15 B A 首先是细胞的透明度降低，随后质内颗粒增加且收缩，由梭形细胞逐渐变为圆形，细胞与细胞之间仅由纤细的细胞间桥连接，细胞单层呈网状结构，进一步细胞间桥也随之消失，细胞脱落。 Reed-Muench两氏法 lgPD50=高于50%保护率的血清稀释度的对数+距离比例×稀释度对数的差 =-1.2+0.33×(-0.3)=-1.299 PD50=-1.299的反对数=0.05=1/20 即1:20稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞免于出现CPE 八、注意事项 无菌操作，生物安全，移液器使用规范 病毒稀释要换吸头，从低浓度病毒液加到高浓度病毒液 细胞一定要混匀，悬空加入，不要碰到待检血清或者病毒液 96孔板放入含5%CO2的培养箱 5个孔的待检血清必须要来自一份血清样品，血清一般需要56℃灭活30min 1：2 1：4 1：8 1：16 1：32 1：64 1：128 1：256 serum 待检血清 待检血清毒性对照 病毒对照 200TCID50 20TCID50 2TCID50 0.2TCID50 阳性血清对照 阴性血清对照 细胞对照 九、思考题 血清中和实验的原理及用途 血清中和实验要设置哪些对照？其意义是什么？ 以下三种表述有区别吗？实验组中每孔实际加入了多少病毒液（200TCID50 or 100TCID50),为什么？ 每孔用50ul病毒（200 TCID50/0.1ml）接种至各试验孔内 每孔用50ul病毒（100 TCID50/0.05ml）接种至各试验孔内 每孔用100ul病毒（100 TCID50/0.1ml）接种至各试验孔内 如何判断接种病毒量是否正确？ 蚀斑减数试验