动物分子生物学第九章 核酸的序列测定技术.ppt

* * * * （2）大规模基因组测序的两种策略 逐步克隆法（clone by clone） 全基因组鸟枪法(whole genome shot-gun) 或霰弹法 基因组测序的逐步克隆法 1）用全部染色体分别建立酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC）克隆群，人工染色体的插入片段平均长度为500-1000kb； 2）利用易于检测的DNA标志 (STS) 建立克隆之间的联系，组成有序排列的YAC连续克隆系； 3）根据DNA的标志或已知基因，将YAC克隆分别定位于染色体的不同区域，构成了全基因组的物理图谱； 4）对单个的YAC克隆分别进行细致的物理图谱分析，并逐组切割成易于操作的小片段，分别进行亚克隆，直到能够用于DNA的测序样本； 5）解读序列分析图，根据序列的重叠，将其依次排列，最终得到全长DNA的序列。 基因组测序的鸟枪法 鸟枪法是利用超声处理、核酸酶Ⅰ切割或限制性内切酶切割，将长链DNA随机断裂成适于测序的片段，把这些片段装入适当载体，建立亚克隆文库，含有子片段的亚克隆扩增后分别进行DNA序列测序，然后将序列重叠排列，最终确定待测DNA的完整序列。 （3）HGP 研究成果 1）发现全部人类基因组约有2.91Gbp，约有39000多个基因； 2）基因数量少的惊人； 3）人与人之间99.99%的基因密码是相同的； 4）人类基因组中存在“热点” 和大片“荒漠”； 5）男性的基因突变率是女性的两倍； 6）人类基因组中约200多个基因是来自插入人类祖先基因组的细菌基因； 7）发现了大约140万个单核苷酸多态性，并进行了精确的定位，初步确定了30多种致病基因； 8）人类基因组编码的全套蛋白质比无脊椎动物编码的蛋白质组更复杂。 在基因组这一前沿领域，我国科学家承担了人类基因组1％的测序任务，是继美、英、法、日、德后成为正式参加国际人类基因组合作项目的第6个国家，也是惟一加入该计划的发展中国家； 克隆了功能新基因的全长cDNA多条，已申请一批国内外专利；证明了东亚人群的基因组与其他现代人群一样起源于非洲等。 我国科学家充分发挥人类遗传资源优势，近年来取得了疾病致病基因定位、克隆的一系列进展。首先在急性早幼粒白血病的致病基因克隆和功能研究方面取得突破，继而克隆了耳聋、短指（趾）等一批单基因疾病的致病基因，近来又定位了 II 型糖尿病、原发性高血压和鼻咽癌的基因。 我国科学家在HGP中承担的任务 本章重点内容 传统测序方法的基本原理 人类基因组计划四种图谱的概念 * * * * * * * * * * * * * * 第二节 短片段高通量测序新技术 1. 二代测序技术 指高通量的测序技术，一次对几十万、几百万条DNA序列进行测序。 二代测序技术的主要原理 合成法测序：通过把大量待测定的模板DNA进行固定，然后与通用引物进行杂交，分别控制4种碱基在DNA引物上的延伸，通过检测延伸碱基，实现高通量并行的DNA序列信息的检测。 连接法测序：通过将模板DNA两端添加接头后再测序。 商用代表：Illumina 公司Solexa测序，Roche (罗氏)公司 454 测序（利用焦磷酸测序的原理，读长超过400bp） 商用代表：ABI公司SOLiD测序（高通量） 罗氏454测序的特点 DNA样品制备 锚定桥接 桥式预扩增 双链DNA变性 单碱基延伸测序与数据分析 二代测序技术的优缺点 优点： 采用高通量测序技术，使测序通量大大提高，一次可读取几百万条序列，大大提高测序的效率。 缺点： 测序前大多对待测片段进行了PCR扩增，因此增加了测序的错误率。另外，测序读长比较短，不适合基因组从头测序（de novo sequencing），更适合重测序（re-sequencing）。 2. 三代测序技术 单分子测序，直接测序，无需PCR扩增，主要有两大主流技术： 单分子荧光测序 纳米孔测序 DNA单分子荧光测序： dNTP用荧光标记，高分辨率的相机可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的dNTP被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键以后，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。 纳米孔测序: 使用外切酶从单链DNA末端逐个切割，形成单碱基，被切割的单碱基会落入纳米孔，并和纳米孔内的环胡精相互作用，短暂的影响流过纳米孔的电流强度。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，而4种碱基的带电性质不一样，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。 三代测序技术的商业代表 1. Helicos BioSciences公司开发的HeliScope测序仪。 DNA单分子荧光测序 无需对测序模板进