动物生物技术第五章 动物细胞工程技术.ppt

* 由于细胞融合是一个随机的过程，在已经融合的细胞中，有相当比例的无关细胞的融合体，因此需要筛选去除。筛选过程一般分为两步进行：一是融合细胞的抗体筛选，二是在此基础上进行的特异性抗体筛选。将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在0至数个细胞之间（30％的孔为0才能保证每个孔中是单个细胞），培养后取上清以ELISA法选出抗体高分泌性的细胞；这一过程常被习惯地称作克隆化。将这些阳性细胞再进行克隆化，应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后进行冻存、体外培养或动物腹腔接种培养。 中空纤维反应器由于剪切力小而广泛用于动物细胞的培养。这类反应器由中空纤维管组成, 每根中空纤维管的内径约为200μm,壁厚为50～70μm。管壁是多孔膜,O2和CO2 等小分子可以自由透过膜扩散,动物细胞贴附在中空纤维管外壁生长,可以很方便地获取氧分。 * 单克隆抗体（monoclonal? antibody . McAb） 单克隆抗体与常规抗体相比有如下优点：①单一特异性，与一个抗原决定簇反应；② 可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂；③一经制出，可无限量地供应；④生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原；⑤能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分。 高抗体活性:与多克隆抗体相比，McAb可以工业化大量生产，利用诱生腹水产生的McAb，显著高于任何一种多克隆抗血清的抗体效价，至少高出4倍。 * 用荧光物质标记单抗作为探针，能方便地确定与其结合的相应生物大分子（蛋白质、核酸、酶等）在细胞中的位置和分布 * 自从1984年第一个基因工程抗体人－鼠嵌合抗体诞生以来，新型基因工程抗体不断出现，如人源化抗体、单价小分子抗体（Fab、单链抗体、单域抗体、超变区多肽等）、多价小分子抗体（双链抗体，三链抗体，微型抗体）、某些特殊类型抗体（双特异抗体、抗原化抗体、细胞内抗体、催化抗体、免疫脂质体）及抗体融合蛋白（免疫毒素、免疫粘连素）等。 * complementarity determining region互补决定区(CDR) 为减少鼠源成分,人们进一步用人的ＦＲ替代鼠ＦＲ,形成更为完全的人源化抗体,即除了3个互补决定区(ＣＤＲ)是鼠源的外,其余全部是人源结构,又称ＣＤＲ移植抗体或改型抗体。? Ｖ区中的框架区(ＦＲ) CDR是决定抗原结合位点的唯一结构，因而也是抗体特异性和亲和力的决定部位。 * * 小分子抗体包括：Fab(由完整的轻链和Fd构成)，Fv(由VH和VL构成)，ScFv(单链抗体，VH和VL之间由一连接肽连接而成)，单域抗体(仅由VH组成)，最小识别单位(MRU，由一个CDR组成)以及超变区多肽、双链抗体、三链抗体、微型抗体等几种类型。 小分子抗体的优点是比较明显的： 1. 制备方法较其他基因工程抗体简单。 2.免疫原性要比原来的McAb弱得多。如果将改形抗体构建成小分子抗体，更有可能消除其免疫原性。 3. 由于分子量小，小分子抗体更容易通过血管壁，穿透实体瘤，有利于肿瘤的治疗。 4. 由于没有Fc段，不能与非靶细胞的Fc受体结合，更能集中到达肿瘤部位，同时由于没有Fc调节IgG的分解代谢，在体内半寿期短，周转快，有利于放射免疫成像检查肿瘤。 5. 分子小，能与分布于病毒表面凹槽的抗原结合，有利于病毒性疾病的治疗。 6. 在小分子抗体基因的3’端接上适当的酶基因或毒素蛋白基因，即可大量产生酶连抗体或免疫毒素。 7. 在大肠杆菌中表达，可发酵生产抗体。从而降低成本，使抗体治疗得以普及。 在各种小分子抗体中，单域抗体(VH)和最小识别单位(MRU)显然不含有完整的抗原结合位点，因而作为抗体分子其特异性和亲合力较低。而具有完整抗原结合位点的Fab、Fv及ScFv是目前小分子抗体研究的重点 * 许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接 是一种小分子双价双特异性抗体片段 * 将识别肿瘤抗原的抗体和 识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用 * Zygote：合子，受精卵；blastocyst ：囊胚；Gastrula：原肠胚；ectoderm：外胚层；Mesoderm：中胚层；Endoderm：内胚层； germ cell：生殖细胞 * 干细胞(Stem Cell, SC)是一种具有无限自我复制能力和向多种细胞分化潜能的细胞。其功能是控制和维持细胞的再生。 所有的分化细胞都是G0期,G0期只不过是细胞周期中G1期或G2期的无限延长,而不是细胞周期中G1期或G2期的中断和脱离 quiescent cell：(静止期细胞) 又称Go期细胞，指暂时离开细胞周期，停止细胞分裂