临床免疫学—免疫细胞的分离与功能检测(谢闺娥).ppt

（二）巨噬细胞功能检测 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 意义： 肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力 * * * * * （一）中性粒细胞功能检测 趋化功能的检测 吞噬和杀菌功能的检测 * 趋化功能检测 1.琼脂糖平板法： * 2.滤膜渗透法（Transwell小室法） 1.显微镜检查法 2.溶菌法 3.NBT还原试验 4.化学发光法：原理同NK细胞活性测定 5.流式细胞仪检测 吞噬和杀菌功能测定 * 1．显微镜检查法： 将白细胞与白假丝酵母菌（或葡萄球菌）混合温育后，滴片，加入亚甲蓝染液染色，油镜观察白细胞对细菌的吞噬和杀伤情况。 * 2. 溶菌法 杀菌率（%）=（1- 作用30.60.90min菌落数之和 0min菌落数 ）×100% * 3．硝基四氮唑蓝（ NBT ）还原试验 中性粒细胞在吞噬杀菌过程中，能量消耗剧增，细胞内氧化代谢明显增强，磷酸己糖旁路代谢活力增强，葡萄糖6-磷酸氧化脱氢，此时NBT可接受所脱的氢，使原先呈淡黄色的NBT还原成点状或块状的蓝黑色甲臜颗粒并沉积于胞浆中。 * （二）巨噬细胞功能检测 炭粒廓清试验 溶酶体酶测定 细胞毒作用测定 比色法 巨噬细胞促凝血活性测定 流式细胞仪检测 * 激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子，加速正常血浆的凝固。 取已经37℃预温的正常兔血浆和CaCl2混合液，加入粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置37℃，即时记录血浆凝固时间。 巨噬细胞促凝血活性测定 通过检测巨噬细胞吞噬荧光微球的能力来评价巨噬细胞功能。 将荧光微球经BSA预调理，再与已激活的巨噬细胞37℃避光共孵育，弃上清，刮下贴壁的巨噬细胞用PBS定容后，FCM分析。 流式细胞仪检测 小结2 T细胞功能检测 B细胞功能检测 NK细胞功能 淋巴细胞功能 吞噬细胞功能 T细胞增殖试验 T细胞分泌细胞因子功能测定 T细胞介导的细胞毒试验 血清免疫球蛋白水平测定 B细胞增殖试验 分泌抗体能力试验：ELISPOT 化学发光法 流式细胞仪法 中性粒细胞功能 巨噬细胞功能 巨噬细胞促凝血活性测定 流式细胞仪检测 琼脂糖平板法 滤膜渗透法 显微镜检查法 溶菌法 NBT还原试验 化学发光法 流式细胞仪法 * 1、免疫细胞主要包括哪些细胞？ 2、T细胞和B细胞进一步区分亚群的方法有哪些？试分别简述其原理？ 3、如何对T细胞、B细胞进行数量检测？ 4、T细胞、B细胞、NK细胞的主要表面标志是什么？ 5、T细胞功能检测方法有哪些？ 6、T细胞增殖试验的原理、刺激物及方法学评价。 7、B细胞功能检测的方法有哪些？ 思考题 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 第二节 免疫细胞的分类计数 原理：由于T、B、NK淋巴细胞、单核细胞等在不同发育阶段以及不同的发育谱系，其分化抗原的表达各有特点，所以可以通过识别其特征性表面分化抗原等表面标志来实现对免疫细胞的分类计数。 免疫细胞亚群 特征性分化抗原 辅助性T细胞 CD3+/CD4+/CD8- 细胞毒性T细胞 CD3+/CD4-/CD8+ 调节性T细胞 CD3+/CD25+ B-1细胞 CD19+/CD5+ B-2细胞 CD19+/CD5- NK细胞 CD3-/CD56+/CD16+ 单核细胞 CD14+ 免疫细胞细胞亚群及特征性分化抗原 现在最常用的分类计数方法：流式细胞术 一、 T细胞数量的检测 二、 B细胞数量的检测 三、NK细胞数量的检测 * 一、 T细胞数量的检测 E花环试验 免疫组织化学法 微量细胞毒试验 抗体致敏细胞花环法 免疫荧光法 抗原肽四聚体法 流式细胞术 * 抗体致敏细胞花环法 + 致敏RBC + CD8单克隆抗体 计数花环百分率，即为CD8阳性细胞百分率 * 间接免疫荧光法 * 抗原肽四聚体法 MHCⅠ类分子-抗原肽四聚体，能同时结合1个抗原特异性T细胞的4个TCR，直接染色抗原特异性T细胞。然后通过流式细胞仪等即可检测抗原特异性T细胞的数量及比率。 * 二、B细胞数量的检测 B细胞表面有膜免疫球蛋白（mIg)、CD抗原、Fc受体、补体受体等表面标志。 1、mIg的检测 2、CD抗原检测 3、Fc受体和补体受体的检测 * 膜免疫球蛋白（ mIg ）的检测 膜免疫球蛋白：为B细胞特有，是鉴定B细胞可靠的指标。 检测方法：免疫荧光法、酶免疫组化法、流式细胞术等 * CD抗原的检测 B细胞表面有CD19、CD20、CD21、CD22、CD23等分化抗原，有些是全部B细胞所共有，而有些仅是活化B细胞特有，据此可用相应的系列单克隆抗体