非洲猪瘟诊断技术研究与应用.pptx

非洲猪瘟诊断技术研究与应用当前非洲猪瘟的诊断要点一目 录非洲猪瘟病毒荧光热对流PCR的研究与应用二CONTENTS非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测技术的研究与应用三一、当前非洲猪瘟的诊断要点已清场猪场未发病猪场可疑/发病猪场如何保证持续平稳生产？如何快速诊断并定点清除？如何成功实现复养？准确、快速的诊断检测至关重要二、非洲猪瘟病毒荧光热对流PCR的研究与应用核酸诊断的特点灵敏度高，特异性好：可实现准确诊断实验条件要求高、操作复杂、耗时长：难以实现现场快速诊断易污染：难以清除核酸污染如何实现核酸诊断的准、快、便、净1、荧光热对流PCR的反应原理荧光定量PCR荧光热对流PCR58~60℃退火温度梯度延伸94~96℃变性热循环模块通过升温降温产生温度梯度温差→密度差→对流，形成持续的温度梯度荧光检测模块qPCR仪cPCR扩增仪一体化计算分析模块电脑2、荧光热对流PCR的核心技术传统PCR单一加热模块热对流PCR?低温低温退火适温延伸引物探针：特殊修饰DNA聚合酶：特殊改造，高效扩增缓冲液：抗干扰，免提核酸高温变性高温专利管型双恒温模块充分对流，一次性密封变性、退火、延伸三步合一更快、更净！更快！更快、更准、更方便！3、荧光热对流PCR的操作流程传统PCR?检测时间≥70min结果判定扩增检测PCR配液取样核酸提取≥40min＞30min热对流PCR?检测时间20-30min扩增检测、结果判定直接取样cPCR配液4、农业农村部非洲猪瘟诊断试剂评价结果第二批产品总数普通荧光PCR（qPCR）荧光热对流PCR（cPCR）等温扩增类第一批11801第二批342716洛阳普泰生物技术有限公司非洲猪瘟病毒荧光热对流PCR（cPCR）快速检测试剂盒5、ASFV荧光热对流PCR与qPCR的灵敏度比较产品名称样品稀释度10-50.75×10-50.5×10-50.25×10-510-6国产1-qPCR+++--国产2-qPCR++---国产3-qPCR+----国产4-qPCR++++-国产5-qPCR++---进口1-qPCR++++-进口2-qPCR+++--洛阳普泰-cPCR++++-6、ASFV荧光热对流PCR的临床应用地 点样品类型特异性敏感性猪场1口腔、全血拭子12/126/6猪场2血浆12/126/6血清10/102/2饲料2/24/4猪场3血清18/186/6唾液6/66/6组织18/1810/10饲料5/57/7屠宰场血清18/186/6肌肉18/182/2荧光热对流PCR适用于各种临床样品的检测7、ASFV荧光热对流PCR仪和配套试剂非洲猪瘟病毒荧光热对流PCR（cPCR）快速检测试剂盒（用于检测猪血清、全血、组织、拭子等样本中的非洲猪瘟病毒（ASFV）核酸）便携式cPCR移动检测实验室便携式cPCR扩增仪二、非洲猪瘟病毒荧光热对流PCR的研究与应用ASFV荧光热对流PCR快速检测试剂盒准：敏感性、特异性和荧光定量PCR相当快：免核酸提取、扩增时间短（20min）便：仪器小型便携、操作简单、自动显示结果、非专业人员可现场操作净：无提取过程，减少核酸污染；特制cPCR管全程封闭，避免核酸污染抗原检测是否可以满足现有临床的所有需求？ASFV感染史ASFV抗体的监测ASFV疫苗三、非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测技术的研究及应用结构复杂，编码160多种病毒蛋白ASFV是一个十分巨大、复杂的病原体糖基化修饰蛋白：CD2v、A238L含跨膜区蛋白：p54、EP153R多聚蛋白：p62、p220不需后续修饰的蛋白：p72、p30蛋白酶、核酸酶：S273、D250R三、非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测技术的研究及应用1、核心抗原的研究--ASFV相关蛋白的表达与纯化CHO表达系统杆状病毒表达系统大肠杆菌表达系统根据不同蛋白是否需要糖基化修饰、是否含有跨膜区、是否有细胞毒性等特性，选择不同的表达系统三、非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测技术的研究及应用1、核心抗原的研究--ASFV相关蛋白的表达与纯化蛋白分类结构蛋白病毒组装相关蛋白免疫逃避相关蛋白毒力相关蛋白复制相关酶类蛋白MGF360其它蛋白数量23416316653种表达系统7类73种蛋白截止2019年12月27日三、非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测技术的研究及应用1、核心抗原的研究-- ASFV相关蛋白的表达与纯化McAb诊断试剂进展阶段小鼠免疫ELISA筛选细胞鉴定腹水制备单抗纯化胶体金纸条调试蛋白数量443025161010纯化的蛋白已获得针对25种蛋白的417株杂交瘤细胞针对10种蛋白的216株单抗进行了纯化和纸条调试截止2019年12月27日三、非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测技术的研究及应用2、抗体检测试剂盒的研发—样品盘的建立敏感性样品盘特异性样品盘2016-2017年临床血清亚单位疫苗免