质粒的提取及鉴定.pptxVIP

实验六质粒DNA的少量提取及鉴定;目的要求 了解质粒的概念。 熟悉提取质粒的基本原理。 掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。 ;a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？;质粒的定义 质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。 ;;质粒DNA的一般特性： (1)宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA要大得多 (2)它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。 (3)质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。 (4)它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型：菌毛、抗药性等 ;分离纯化质粒DNA的主要步骤;原理示意图;实验原理：;试剂盒主要试剂及作用; 溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性) ① SDS是离子型表面活性剂,其主要作用是：溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；使蛋白质变性而沉淀下来。SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下来的提取过程必须把它去除干净，以便后续更好地进行。 ② NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用）可瞬间溶解细胞及细菌。;溶液III：pH4.8 KAC(乙酸钾) 高盐溶液，pH调至中性 (复性，分离) ①中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。 ②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成 沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。;吸附株纯化质粒DNA;实验步骤; 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。 在碱性环境下，DNA的磷酸基团解离，使DNA带负电荷，在电场中向正极方向泳动，因各种DNA分子的电荷数、分子量、构象不同，在通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的。 ;实验材料及试剂 ;DNA Marker：是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题，以及粗略判断样品的分子量。 DNA Marker应选择在目标片段大小附近ladder较密集的marker，这样对目标片段大小的估计较准确。;影响DNA在凝胶中迁移速率的因素 ;OC 型质粒DNA;实验步骤;移液器的使用;移液器的使用;移液器的使用;移液器的使用;移液器的使用; 1、加样枪正确使用； 2、标记自己所提取的质粒类型； 3、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中； 4、加不同溶液要换枪头； 5、离心前把管擦干； 6、转移上清时不要吸到沉淀； 7、使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出现混浊； 8、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和漂洗液使用后应立即拧紧盖子。 9、洗脱液不少于 50μl，-20℃保存，以防 DNA 降解。 ;1.凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定，所 以电泳前应对DNA片段大小有粗略估计。 2.加EB时，胶的温度不要太高。高温会导致EB挥 发，EB有致癌性。倒胶时避免产生气泡。 3.缓冲液要完全没过点样孔。点样孔不能有气泡。 4.紫外线照射不要太久。尤其避免直接照射皮肤。 ;质粒的定义 质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。 ;基因克隆示意图;2 BamHI 、HindⅢ酶切质粒及鉴定;实验七 质粒DNA质粒DNA的浓度测定与双酶切鉴定; 1.熟悉DNA的浓度测定方法。 2.了解限制性核酸内切酶在基因工程中的应用。 3.熟悉利用限制性核酸内切酶切割质粒的方法。;实验原理;1. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0;DNA样品的浓度（μg/μl）= OD260×稀释倍数×50/1000 OD260/OD280=1.7-1.9;限制性核酸内切酶 定义：能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段。 切割不同来源的DNA分子将产生特征