鹦鹉热衣原体mip基因原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备.pptxVIP

鹦鹉热衣原体 Mip 基因原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备时 间：2017- 6 - 141324 关于问题的研究选题背景及意义目的基因的获取及扩增目的基因的克隆及鉴定目的蛋白的诱导表达及纯化1选题背景及意义选题背景及意义 鹦鹉热衣原体(Cps)是一种专性细胞内寄生，有独特生活周期的原核细胞型微生物，也是一种重要的人畜共患病病原体，具有广泛的感染谱。人主要通过吸入有感染性的分泌物而发生感染，感染后可引起非典型性肺炎和败血症等疾病。目前为止，Cps 的确切致病机制不清楚，也无有效疫苗上市，开发有效的疫苗是预防 Cps 感染最根本的措施。选题背景及意义 巨噬细胞感染增强蛋白(Mip)是衣原体含量最丰富的脂蛋白，在衣原体各种属间都存在且高度保守。相关研究表明：Mip可刺激THP1细胞产生一系列炎症因子，参与衣原体对宿主细胞的侵袭及炎症反应。Mip可诱导小鼠产生以Th1型为主的细胞免疫反应，且抗感染实验表明免疫后的小鼠能抵御生殖道衣原体感染及再感染等。由此可见，衣原体Mip蛋白是一种较理想的疫苗候选抗原。 本实验拟克隆Cps Mip基因，构建原核表达载体， 诱导表达及纯化可溶性蛋白，并制备多克隆抗体。2目的基因的获取及扩增获取目的基因（Cps Mip基因） 分离和鉴定目的cDNA克隆提取总RNA鉴定cDNA文库分离mRNA将重组体导入受体细胞合成cDNA双链 连接cDNA与载体制备载体图1 cDNA文库法获取目的基因重组酵母的方法此实验采用重组酵母的方法原因如下：酵母对培养基的要求低，价廉易得酵母细胞生长快，生长率高酵母系统容易放大导入酵母细胞构建重组质粒分离目的基因培养合适酵母扩增目的基因（PCR原理） Cps Mip 基因上游引物设计上游引物:5-CGCGGATCCATGAAAAAACAATGGTATT-3 下划线为 Bam H I 酶切位点 Cps Mip 基因下游引物设计下游引物: 3-CCGCTCGAGTCATGAAGCTGTGTTTTT-5 下划线为 Xho I 酶切位点 PCR反应体系10×缓冲液10μL4种dNTP混合物 各200μmol/L引物1、2各10～100pmol模板DNA 0.1～2μgTaq DNA聚合酶2.5U总体积： 加水至100μLCps Mip基因的PCR扩增预期结果 Cps Mip 基因经PCR扩增后，1. 5% 的琼脂糖凝胶电泳， 预期目的基因大小如下图：目的条带预测位置图2：Cps Mip 基因 PCR产物琼脂糖凝胶电泳3目的基因的克隆及鉴定PCR产物的琼脂糖凝胶电泳回收1.电泳缓冲液配制2.融胶3.倒胶4.加样5.电泳(先低电压低电流产生细条带，便于切胶，再高电压快速分离)6.观察7.切胶8.融胶9.结合（吸附柱）10.洗涤11.洗脱感受态细胞的制备（CaCl2法）（1）在无菌环境中，挑取冻存于-70℃冰箱的菌种E.coli BL21划线接 种于不含任何抗生素的LB琼脂平板上，37℃倒置培养12~16h左右;（2）从平板中挑取单个菌落，接种5mLLB液体培养基中，37℃、200rpm， 过夜振荡培养;（3）次日在无菌环境下吸取1mL菌液加入到50mL含卡那霉素的LB液 体培养基中，37℃、200rpm振荡培养，至菌液的OD600值在 0.3~0.5之间;感受态细胞的制备（CaCl2法）（4）无菌条件下，将菌液转移到冰预冷过的无菌离心管中，冰浴15min， 使培养物冷却至0℃; （5） 4℃、4000rpm离心10min轻轻倒掉上清，回收沉淀，加入10mL冰 预冷的 0.1mol/L CaCl2溶液重悬沉淀，冰浴10min(务必放冰上); （6） 4℃、4000rpm离心10min，收集沉淀，用2mL冰预冷0.1mol/L CaCl2溶液重悬菌体; （7）分装重悬好的感受态细胞，每管100 μ L，-70℃冰箱保存待用。将Cps Mip基因连接到T载体上重组质粒的转化将重组质粒转化至 E. coli BL21 感受态细胞中，用含卡那霉素的 LB 固态培养基培养过夜。用质粒DNA小量抽提试剂盒制备质粒DNA1、菌液培养：挑去单克隆菌落接种到5μL含卡那霉素的液体培养 基中，37 ℃ 培养12h；2、收集菌体：将菌液转移到1.5mL离心管中，10000r/min， 1min,将培养液彻底吸掉；3、离心管中加250μL预冷的SolutionI；4、加入250 μLSolution II上下翻转4-6次，呈蛋清状；5、加入350 μLSolution III上下翻转8-10次，室温放置2- 5min，12000r/min，5min；用质粒DNA小量抽提试剂盒制备质粒DNA6、将上清液转入吸附柱中，6000r/min，1min