质粒转染后luciferase检测操作手册.docx

质粒转染后 luciferase 检测 操作手册 实验流程描述 培养生长状态良好的 293T 细胞， 质粒转染前一天将细胞分入 24-well 培养板培养， 转染 当天按实验设计的组别进行质粒转染实验。转染 24 小时后荧光显微镜下观察细胞内荧光标 记基因（如 GFP）的表达情况，然后使用“ Dual- Glo? Luciferase Assay System E2920 （， promega ）”试剂盒处理细胞、进行 luciferase 表达检测。 实验材料 ： 试剂 试剂名称 试剂来源 cat.No. 胎牛血清 FBS GIBCO DMEM GIBCO 胰酶 上海化学试剂公司 Opti-MEM Invitrogen Dual- Glo? Luciferase promega E2920 Assay System 仪器 仪器名称 仪器来源 cat.No. 1/ 4 荧光显微镜 奥林帕斯 micropublisher 3.3RTV CO2 培养箱 日本三洋 SANYO MCO-175 生物安全柜 上海振样创空气净化设备公司 Bio 1200- Ⅱ -A2 酶标仪 睿星公司提供 实验步骤： 准备目的细胞 1.1 细胞复苏 从液氮罐中取出细胞冻存管 迅速放入 37 ℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻 完全解冻后， 1000 rpm ，离心 2 min 75% 酒精擦拭冻存管消毒后，移至超净台 5) 吸去冻存液上清，加入 1 ml 新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有 3 ml 完全培养基的 6-cm dish 中，轻轻晃匀后置于 37 ℃、 5%CO 2 培养箱培养 次日更换一次培养液后再继续培养 1.2 细胞传代 将生长至 90% 汇合的细胞进行传代 弃去旧培养液，加入 2 ml 灭菌的 D- Hank ’ s 溶液，洗涤细胞生长面，然后弃去该溶液 加入 1 ml 胰酶消化液， 37 ℃消化约 1-2 min ，直到细胞完全消化下来 加入完全培养基 2ml ，用刻度吸管吹打数次，将壁上的细胞冲洗下来 5) 混匀细胞后分至两个新的 6-cm dish 中，补足完全培养基至 4ml ，继续培养 目的细胞质粒转染 2/ 4 将处于对数生长期的 293T 细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液 将细胞悬液（细胞数约为 4×10 5 ）接种于 24-well 培养板中， 37 ℃、 5%CO2 培养箱培养至细胞融合度达到约 80% 3) 根据 invitrogen lipofectamine 2000 转染试剂使用说明书进行转染操作： 将培液换成 400 μ l 的opti-MEM 培养基 b) 每孔转染 1 μ g 质粒、需要2 μ l lipofectamine 2000 ，按照此比例，将质粒和 lipofectamine 2000分别溶解于 opti-MEM 中，混匀，室温静置 5 min c) 将 b) 中稀释好的质粒和 lipofectamine 2000 混匀，室温静置 20 min d) 把质粒 DNA 与Lipofectamine 2000 的混合液加入 293T 细胞中， 37 ℃ 5%CO2 培养箱中培养 5 小时后，换成新鲜的含 10% 血清的完全培养基 转染 24 小时后观察质粒上荧光标记基因的表达情况以判断转染效率，同时该过程用来平衡培养体系至室温下 3. luciferase 检测 1) 初次使用 Dual- Glo? Luciferase Assay kit 时，需要将 Dual- Glo? Luciferase Buffer 和 Dual- Glo? Stop Glo? Buffer 提前数天放于室温下平衡； 将 Dual- Glo? Luciferase Buffer 完全加入到 Dual- Glo? Luciferase Substrate 瓶中，完全溶解底物，形成 Dual- Glo? Luciferase Reagent ，分装保-存70于℃ 2) 24 孔板中每孔去除 250 μl培养基，加入剩余体积同等量（即 250 μ l ）的Dual- Glo? Luciferase Reagent ，室温反应 10min 以待细胞充分裂解，吹打混匀转移至 1.5mL ep 管 中 3) 根据需要的量配制 Dual- Glo? Stop Glo? Rea gent 待用（该试剂必须现配现用）， 如配制 1.1mL Dual- Glo? Stop Glo? Reagent ，即11取μlDual- Glo? Stop Glo? 3/ 4 Substrate 加入到 1089 μlDual- Glo? Stop Gl