流式检测细胞内钙离子.docxVIP

用 Furo-3/AM 检测细胞内钙离子浓度 FSC forward scatter 480nm SSC side scatter 480nm FL1 515-545nm 绿色 FL2 564-606nm 橙色 FL3 650- 红色 1, 实验目的： 检测不同细胞株中细胞质内钙离子浓度的差异，以检测钙离子浓度对癌细胞的迁移性的影 响。 ， 检测迁移性不同的 FBJ-LL-H 于 S1-H 两株细胞中细胞内钙离子浓度的差异。 ， 检测间质作用因子 Stim1 对细胞内钙离子浓度的影响 包括对照组细胞，Stim1 表达的 几株单克隆细胞 ， 观察细胞 ER 钙离子释放之后的钙离子内流 2, 样品处理： 1. 储备液配制 F-127 5mg + 25uL DMSO 终浓度 20% 0.05mg Fluo-3/AM +22uL DMSO F127 与 Fluo-3/AM 以体积比 1 比 1 混合 终浓度为 2 ?M 2. 消化细胞 3*10e6/mL-1*10e7/mL 细胞混悬液加入 Fluo-3/AM，使之终浓度为 4 ?M 避光 37℃ 45min PBS(-)清洗 2 遍 用 PBS(-)重悬细胞，将浓度定为 1*10e6/mL 当用毒胡萝卜素 Thapsigargin（TG）排空细胞内质网钙池钙离子时, 用终浓度为 3 ?M 的 TG 孵育 15min， 上样 20 s 后加入钙离子使其终浓度为 1 ?M 观察钙离子内流 7, 为观察细胞在加入 TG 之后胞内钙离子的变化，将未经 TG 处理的细胞上样 20s 后加入 TG 观察钙离子浓度变化，正常情况下 TG 加入后因为钙池钙离子的释放胞内钙离子浓度会 有一个上升的过程，随后因为钙泵失效，钙离子会逐渐降低。 流式细胞仪 Coulter 图·横轴 时间 time 纵轴 荧光强度（FL1） 取 400uL 混悬液，（40-秒 baseline monitoring？）上样持续检测 1-3min 激发光波长 488nm 发射波长 530nm 数据处理  CellQuest software 实验原理：Fluo-3-Am 进入细胞后经非特异性酯酶脱去 Am 酯，成为脂溶的 Fluo-3 留在细 胞内，当 Fluo-3 与细胞内游离钙结合后，其荧光强度是 Fluo-3 本身的 40 倍以上，当用 480nm 波长激发时，其荧光强度与游离钙离子浓度成正比。 参考文献中的检测方法： 1. CCL19 和 CCL21 能激活钙内流，细胞内高表达当 CCR7 变异形式 MT1 或者 DNY 时，钙离子内流被阻止。用钙离子载体 ionmycin 作为阳性对照。 样品处理 Furo-3/AM 储备液配成 4mM，最终以 1.5uL/mL 加入 10e6/mL 的细胞混悬液中，37℃ 孵育 30min，将其分成不同的组分并加入不同的激动剂 CCL19，CCL21，ionomycin， 持续检测钙离子浓度 150 秒。 HEPEs buffer 260.3 2. mSDF-154 不含 a 螺旋尾巴的 mSDF 变异，细胞内加入 mSDF 多肽能引起钙离子 内流，而不含 a 螺旋的 mSDF 变异能阻止其功能。 实验方法： 5*10e9/L 细胞中加入 Furo-3/AM 终浓度 4uM， 室温避光孵育 45min，用不含酚红 RPMI 培养基，加入 SDFWT 或 SDFmt，孵育 15min 后上样检测。 3．mSDF 含 a 螺旋于不含 a 螺旋引起不同的钙离子内流 样品处理; 10e7 细胞悬浮于钙离子分析缓冲液中，加入 fluo-3/am 使其终浓度为 4uM，室温孵育 45min，用缓冲液清洗 3 次，重悬于缓冲液中暗室放置备用。每个样品做一个 40s 的基准线 调试（basement monitoring？）片刻后快速加入 SDF-WT 和 SDFmt，检测钙离子浓度。