第2部分：血清4型Ⅰ群禽腺病毒感染PCR和荧光定量PCR诊断技术-山东地方标准.docVIP

DB 37/T ××××—×××× PAGE 6 ICS FORMTEXT 65.020.30 FORMTEXT B41 FORMTEXT DB FORMTEXT 37 FORMTEXT 山东省地方标准 DB FORMTEXT 37/T FORMTEXT ××××— FORMTEXT 2020 FORMTEXT FORMTEXT Ⅰ群禽腺病毒感染诊断技术　第2部分：血清4型Ⅰ群禽腺病毒感染PCR和荧光定量PCR诊断技术 FORMTEXT Diagnostic techniques for fowl adenovirus group I　Part 2: Detection method on fowl adenovirus group I serotype 4 by PCR and quantitative real-time PCR FORMTEXT 2020- FORMTEXT ××- FORMTEXT ××发布 FORMTEXT 2020- FORMTEXT ××- FORMTEXT ××实施 FORMTEXT 山东省市场监督管理局 发布 DB 37/T ××××—2020 PAGE 7 前??言 本标准按照GB/T 1.1－2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东农业大学。 本标准主要起草人：刁有祥、唐熠、杨晶、王鸿志、陈浩、冯强、张吉、宋存鑫、李伟。 Ⅰ群禽腺病毒感染诊断技术　第2部分：血清4型Ⅰ 范围 本标准规定了血清4型Ⅰ群禽腺病毒聚合酶链式反应（PCR）与实时荧光定量PCR（qPCR）检测方法的范围、规范性引用文件、术语和定义、实验室要求、样品、结果判定等。 本标准所规定的血清4型Ⅰ群禽腺病毒PCR与实时荧光定量PCR检测方法适用于检测鸡组织、分泌物、排泄物和鸡胚尿囊液及细胞培养液中血清4型Ⅰ群禽腺病毒的核酸，也适用于鸭、鹅及鸭胚、鹅胚尿囊液血清4型Ⅰ群禽腺病毒核酸的检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489　实验室生物安全通用要求 GB/T 27401　实验室质量控制规范动物检疫 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 血清4型Ⅰ群禽腺病毒　Fowl adenovirus group I Serotype 4 是引起禽心包积水-肝炎综合征的病原，主要造成3周龄～5周龄家禽突然死亡，并伴随有心包积水和肝炎。 实时荧光定量PCR　Quantitative Real-time PCR（qPCR） 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。 实验室要求 环境 实验室符合GB19489和GB/T 27401要求，实验室必须为生物安全Ⅱ级（BSL-2级）及以上实验室。 从事PCR工作的实验室应进行分区，根据条件划分出前处理区、核酸提取区、核酸扩增区、电泳检测区，形成有效的物理隔离，且为单一流向，不得倒流。特别注意电泳后的琼脂凝胶要及时处理，避免对实验室造成污染。 生物样品应严格控制对环境的污染，试验结束后应将相关样品收集高压灭菌后，送有资质的医用垃圾处理公司做处理。 人员 操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理、细胞培养和分子生物学实验室检测技术培训。熟悉生物样品处理、细胞培养、以及核酸提取、基因扩增等分子生物学技术，熟悉PCR与qPCR检测结果的判断方法。 仪器设备 生物安全柜。 PCR仪（温度差小于0.3 ℃）。 台式低温高速离心机（最大转速为15000 rpm）。 电泳仪。 电泳槽。 紫外凝胶成像仪。 冰箱：2 ℃～8 ℃。 冰柜：-20 ℃。 微量移液器（最大量程分别为10 μL、20 μL、100 μL、1000 μL），带滤芯的枪头。 电子天平：精度为0.001 g。 电磁炉或微波炉。 荧光定量PCR仪。 试剂或材料 除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯，水符合GB/T 6682规定的一级水。 DNA提取试剂盒。 rTaq DNA聚合酶：5U/μL。 10×PCR 缓冲液。 dNTPs：2.5 mmol/L, 10 mmol/L。 荧光定量PCR试剂盒。 1.5%琼脂糖凝胶，见附录A.1。 1×TAE缓冲液，见附录A.2。 溴化乙锭（10 μg/μL），见附录A.3。 核酸电泳加样缓冲液，见附录A.4。 DNA分子量标准，要求在100 bp～2000 bp之间，有5条以