医学07 生化技术tan.ppt

（三）总 RNA 1 、破碎细胞：胍、酚等变性剂， 注意缩短组织匀浆时间 2 、除核蛋白：低盐、离心 3 、除少量 DNA ： 不含 RNase 的 DNase 4 、除多糖： 12000rpm 以上离心 5 、除盐等小分子：乙醇沉淀 6 、进一步纯化，除痕量蛋白等杂质：蛋白酶 K 、酚氯仿抽提、 柱层析 注意： 防 RNase RNasin ，专一抑制剂（蛋白） DEPC 处理水、浸泡 /120 0 C 消毒， 180 0 C 烤 器皿胍盐中储存 氧钒核苷复合物（较难除去） 紫外分光法原理： 在 260nm 下，核酸（ DNA 、 RNA ）有最大吸收，这是由它们含有 的嘌呤环和嘧啶环的共扼双键系统的特性所决定的。通常每毫升 1 微克的 DNA 钠盐溶液的光密度为 0.020 ，每毫升 1 微克的 RNA 钠盐溶 液的光密度为 0.025 ，所以核酸浓度与光密度值有以下关系： dsDNA （ ug/ml ） = OD 260 * 50 ssDNA （ ug/ml ） = OD 260 * 37 RNA （ ug/ml ） = OD 260 * 40 OD 260 、 / OD 280 在 1 .8~2.2 内核酸样品比较纯。 总量 定量 、鉴别方法 DNA RNA PROTEIN 化学法 二苯胺法 苔黑酚法 双缩脲、 Folin 酚、 染色、凯氏定氮 （不需纯化） 物理法 UV260 UV260 UV280 电泳法 电泳法 电泳法 （四）质粒载体 ? 1 、破碎细胞： NaOH 、 SDS 等变性剂 ? 2 、除核蛋白：低盐、离心 ? 3 、除少量 RNA ： 不含 DNase 的 RNase ? 4 、除多糖： 12000rpm 以上离 心 ? 5 、除盐等小分子：乙醇沉淀 ? 6 、进一步纯化，除痕量蛋白 等杂质：酚氯仿抽提、柱层 析、旋转柱层析、梯度离心 ? 注意：防开环、断开 污染核 DNA 片段 1 2 3 4 5 2 为质粒，可见 2 种构型， 3 为单酶切质粒 1 、 5 为 MARKER 构型：超螺旋 线状 开环 （五）特殊要求的核酸分子分离纯化方法 分离特定长度的 DNA 如获得目的基因、探针、 PCR 产物回收 、酶切 后的克隆载体 1 、电泳洗脱法 高分辨，普通琼脂糖有杂质，用高纯度或低熔点 电泳挖孔法 琼脂糖，或 胶回收试剂盒 2 、密度梯度离心法： 常用介质有甘油、蔗糖、氯化铯（昂贵） 密度梯度仪 不同长度 DNA 停留在离心管不同高度 经密度梯度离心，样品纯度极高 3 、柱层析与旋转柱层析： Sephadex-G50 ： 去除很短核酸片段和 dNTP, 纯化探针 各种提取、浓缩、分子量截留试剂盒 五、总蛋白质的分离纯化方法 1 、破细胞 SDS 等，超声波、低温研磨或匀浆、酶法 2 、利用溶解度的特点，调节 pH 、离子浓度等使蛋白质 溶解。离心 3 、分级盐析 常用（ NH 4 ） 2 SO4 4 、相分配法使蛋白与核酸分开，低盐条件下蛋白与核蛋白分 开，再调到到 4M NaCl ，则蛋白质在上相，核酸在下相。 5 、柱层析进一步纯化 6 、透析除盐、小分子 试剂盒 生化分子生物学技术在医药学中应用举例 一、 PCR 技术 —— DNA 片段扩增技术 1. 基因诊断、分子病理（医） 临床用于检测 传染病 的病染体、 遗传病 的变异基因、 肿瘤 的癌基因与抗癌基因、测定某 疾病相关基因 表 达水平等 2. 物种鉴定、分子药理（药） 中药学上应用随机引物 PCR （ DNA 指纹法、 DNA 多 态性分析） rRNA 间隔区长度法分析进行昂贵地道 药材的鉴定 研究药物对 疾病相关基因 表达的影响 PCR 扩增原理 5 5 3 3 变性、退火、延伸 变性、退火、延伸 变性、退火、延伸 RT-PCR ? mRNA 逆转录为 cDNA ? 以 cDNA 为模板进行目标片段的扩增 ? 第一步，获得模板 —— 待检测对象的细 胞内核酸（ DNA 、 RNA ） 二、基因克隆技术（重组 DNA 技术） 医药领域的应用： 1 、 基因工程制药（干扰素、胰岛素、免疫因 子、生长因子 抗菌肽、凝血因子、乙肝 疫苗、 秋水仙酰胺 、蛇毒等） 2 、基因治疗 肿瘤：抗癌基因、自杀基因、免疫因子、 血管生长抑制因子等 逆转录 酶切 酶切 加接头 酶切 酶切 切 连接 接 转化、转导或转染 转 筛选 选 （ 1 ）基因组 DNA/RNA （ 2 ）载体 DNA （ 3 ）合成或 PCR 扩增 载体 DNA 提 第一步 ，分