精梳版细菌的分离培养与鉴定.ppt

细菌的分离培养与鉴定 一 培养基的制备 二 消毒与灭菌 三 细菌的接种和培养 四 细菌的生化反应 一 培养基的制备 步骤： 1 称量药品 2 溶解 3 调节PH 5 过滤分装 6 包扎标记 7 灭菌 二 消毒灭菌法 物理灭菌法： 干热灭菌法：150-170 ℃ 维持 1-2h； 高压蒸汽灭菌法121℃（101.53kPa）15-30min； 其他：过滤除菌法、紫外线灭菌法。 化学灭菌法：主要使用一些化学消毒剂进行，如：75％酒精、1％的新洁尔灭等。 三 细菌的分离、接种与培养 细菌的分离方法： 稀释法、平板分区划线法。 细菌的接种方法： 斜面培养基接种法、液体培养基接种法、穿刺接种法、倾注平板法、平板涂布法。 细菌的培养方法： 需氧培养法 CO2培养法 厌氧培养法 3.1 细菌的分离培养方法 连续稀释法 平板分区划线 分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的标本如混合细菌的分离。 连续划线分离法：此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养 1区 2区 3区 4区 1 2 3 4 平板分区划线法（学生操作） 注意事项 划完前一区后，需重新灼烧接种环后再进行下一区的划线。 相邻两区要有重叠区域。 结果观察：观察各区的生长情况，并看是否有单一菌落长出；菌落的形态、颜色、大小、边缘、透明度都需记录。 平皿送37℃温箱培养24小时 结果(要求) 两种单个菌落 分四区 无杂菌 琼脂不破 ℃ 3.2 细菌的接种 斜面接种法 该法主要用于单个菌落的纯培养、 保存菌种或观察细菌的某些特性。 液体接种法 多用于一些液体生化试验管或发酵的接种。 穿刺接种法 此法主要用于半固体培养基、明胶 及双糖管的接种。 (1) 斜面琼脂培养基接种法（2人一组） 大肠埃希菌/枯草芽孢杆菌/葡萄球菌 送培养24小时(2支/组) 一组 37℃温箱 一组 60℃温箱 一组 4℃ 冰箱 用接种环挑菌后在斜面表面划折线 (2) 液体培养基接种法（2人一组） 1. 菌种 (任选一种） 大肠埃希菌/枯草芽孢杆菌/葡萄球菌 2. 接种 每一菌种分别接种pH5.0 / 7.2 / 9.0的营养肉汤各一支 3. 送37℃温箱培养24小时 液体培养基 沉淀生长 混浊生长 表面生长 (3) 琼脂半固体接种法 （1人一份） 1. 菌种 大肠埃希菌/枯草芽孢杆菌/葡萄球菌 2. 接种 用接种针穿刺接种 3. 送37℃温箱 培养24小时 3.半固体培养法－观察细菌是否有动力 1、3：有动力： 呈云雾状 2：无动力： 沿穿刺线生长，并变粗 四、细菌的生化反应 1 糖发酵试验(Fermentation of sugars) 2 IMViC 试验 靛基质产生试验（吲哚试验） 甲基红试验 V-P试验 枸橼酸盐利用试验 3 硫化氢产生试验 4 尿素分解试验 糖发酵试验 　 不同细菌分解糖类的能力和代谢产物不同。例如大肠杆菌能发酵葡萄糖和乳糖；而痢疾杆菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖。即使两种细菌均可发酵同一糖类，其结果也不尽相同，如大肠杆菌有甲酸脱氢酶，能将葡萄糖发酵生成的甲酸进一步分解为CO2和H2，故产酸并产气；而痢疾杆菌缺乏该酶，发酵葡萄糖仅产酸不产气。 吲哚（靛基质）试验(Production of indole) 有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸而产生靛基质，靛基质无色，不能直接查见，此时滴加数滴吲哚试剂于培养基的液面上，上层呈玫瑰红色者为阳性，仍呈黄色者为阴性。 甲基红（methyl red）试验 将细菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，37℃培养48h后，再向其中加入甲基红试剂3滴。 大肠杆菌等细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，但丙酮酸不被缩合成乙酰甲基甲醇，而转化成甲酸、乙酸等酸性物质，培养基中酸多，pH值低，故呈红色，为阳性。 而产气杆菌将丙酮酸缩合成乙酰甲基甲醇，培养基中酸少，pH值高，故呈黄色，为阴性。