褐藻胶裂解酶产生菌的分离鉴定及产酶发酵优化.pptx

褐藻胶裂解酶产生菌的分离鉴定及产酶发酵优化褐藻胶裂解酶产生菌的分离鉴定及产酶发酵优化研究目的褐藻寡糖在医药、食品、化工、农业等领域均有应用，其中是抗肿瘤、抗凝血、免疫调节及促进生长等方面。褐藻寡糖主要由褐藻胶降解制备，褐藻胶裂解酶已被普遍认为是定向制备褐藻寡糖的有力工具。对产褐藻胶裂解酶的菌株进行形态学、生理生化特性及分子鉴定，并对培养基的组成及培养条件进行优化。研究方法菌株筛选1菌株鉴定2酶活测定3生物量测定4产酶条件优化5酶解产物分析6菌株筛选通过初筛与富集培养，依据透明圈直径与菌落直径的比值大小进行褐藻胶裂解酶活力的初步判断；结果表明，菌株WF6发酵液酶活较高，发酵时间较短，且产酶能力稳定； 故作为后续试验的研究对象。菌株WF6的鉴定形态学特征菌落成乳白色，圆形，不透明，饱满，表面湿润有光泽，中心突起。菌株显革兰氏阴性。分子生物学鉴定经测序，菌株WF6的16S rDNA基因序列含有1501bp。在genbank数据库中进行比对，显示菌株WF6与Halomonas.sp.JL-81亲缘关系最近。结合形态学特征和生理生化特性，将其归类为盐单胞菌属，命名为Halomonas.sp.WF6。生理生化特征能在1.0%~30.0%NaCl(W/V)浓度的培养基生长，在2.0%~7.0%之间生长情况较好。在PH3.5~9.0的条件下生长，尤其在5.5~8.5生长良好。能在15~45℃生长，最适生长温度为25℃。培养基组成的优化AB氮源对产酶的影响碳源对产酶的影响CDNaCl浓度对产酶的影响金属离子对产酶的影响碳源对产酶的影响选用几种单糖、二糖和多糖分别代替褐藻酸钠作为菌株生长的唯一碳源。只有在以褐藻酸钠为唯一碳源时酶活最高。选择6.0g/L作为褐藻酸钠的最适浓度。氮源对产酶的影响考察不同菌株生长和产酶无机氮源、有机氮源和复合氮源对菌株生长和产酶的影响。含有机氮源的培养基中能检测出一定的酶活，含无机氮源的未检出酶活。以蛋白胨（5.0g/L）和酵母粉（2.5g/L）为复合氮源时酶活最高。NaCl浓度对产酶的影响菌株在低浓度的NaCl环境下生长缓慢，产酶能力低；随浓度增加，酶活大幅提升。当NaCl浓度为25g/L时，菌株产酶能力最强。进一步提高浓度对酶活有抑制作用。金属离子对产酶的影响Mg2+可显著促进菌体生长，但对酶活有少量的抑制作用。K+表现出少量的酶活促进作用，提高幅度10.9%。其浓度在3mmol/L时，菌株产酶能力最强。正交实验结果设计四因素三水平的正交试验L9褐藻酸钠6.0g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母粉2.5g/L，NaCl30g/L，K+5mmol/L。培养条件对产酶的影响初始PH值为8.0时最有利于菌株产酶影响不明显。接种量为2%时，测得酶活最高初始PH温度接种量装液量在25℃时酶活最高，超过35℃时酶活迅速下降菌株好氧，在30ml/250ml装液量时酶活最高优化后菌株WF6的生长及产酶曲线生物量在30h达到最大，39h产酶活力达到最高，约117.66U/ml。与优化前相比，所需产酶时间显著较短，能较快进入生长对数期，生物量也有所增加，酶活力为初始的2.1倍。酶解产物分析采用TCL初步分析，酶解反应产物主要由聚合度为二和三的褐藻寡糖组成。与优化前相比，所得的寡糖聚合度更低，且成分更单一。结论鉴定为盐单胞菌属，命名为Halomonas.sp.WF6。最适产酶培养基：褐藻酸钠6.0g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母粉2.5g/L，NaCl30g/L，K+5mmol/L。发酵条件：初始PH8.0，培养温度25℃，接种量为2%，摇瓶装液量30ml/250ml，培养时间39h。酶活达117.66U/ml，是优化前的2.1倍。菌株Halomonas.sp.WF6产酶培养基成分简单，培养周期短，酶解产物较为单一且聚合度低，具有潜在应用价值。