7 高等动物基因工程报告.ppt

常用的报告基因 氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、β-半乳糖苷酶基因、二氢叶酸还原酶基因、荧光酶基因等。 cat基因，检测可通过放射自显影观察。 荧光酶基因，具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30～1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点。 ., * ., * 动物病毒的特点 1、有能够被真核细胞识别的有效的启动子； 2、在感染周期中能够持续地复制使基因 达到相当高浓度,并实现有效的表达； 3、病毒能具有效控制自己复制的顺式元件和反式作用因子，改造后可发展成为能够在细胞内长时间的保持高拷贝的外源基因的复制型质粒载体； ., * 动物病毒的特点 4、能高效稳定地整合到染色体,可提高外源基因导入寄主细胞染色体的效率； 5、病毒外壳蛋白能够识别细胞接受器，能够将外源蛋白高效地导入宿主细胞(假病毒粒子法)。 ., * ., * ., * ., * ., * ., * ., * ., * ., * ., * ., * ., * ., * 二 反转录病毒载体类型 1. 简介: Retroviruses, 是一类含有单链RNA的动物病毒.基因组含有2条相同的正链RNA分子,包装成二倍体病毒颗粒.此外, 颗粒内还含有tRNA引物分子, 反转录酶,RNaseH, 整合酶等. 2. 分3个类群: 泡沫病毒(foamy viruses )类群, 慢病毒(entiviruses)类群(如HIV-I,II型), 致癌病毒onco viruses类群. ., * 3. 反转录病毒的优点 (1) 大多数情况下,反转录病毒的肿瘤基因都能在正常细胞中转录,利用之作为天然转导因子,改建成载体. (2)寄主范围广, 包括无脊椎和脊椎动物; (3)具有强启动子,有效表达外源基因; (4) 不但感染率高,而且不会导致宿主细胞死亡, 且形成感染性病毒颗粒. ., * 反转录病毒的一般生物学特性 1 生命周期 第一时相 从病毒颗粒脱壳到整合到寄主基因染色体上,成为原病毒(provirus); 第二时相 原病毒开始转录, 合成并加工成mRNA, 进而转译蛋白,组装颗粒,释放病毒. ., * 反转录病毒的一般生物学特性 2 基因组特点 有4条RNA链, r序列, U3(转录加尾信号)和U5(转录起始信号)序列. 3 编码读框 核心部分有3个开放读框,两侧是控制表达的信号区. ., * ., * ., * ., * 5. 反转录病毒载体类型 1、辅助病毒互补的重组的反转录病毒质粒载体； 2、无需辅助病毒互补的重组的反转录病毒质粒 载体； 3、广寄主范围的反转录病毒载体； 4、反转录病毒表达载体. ., * 1、辅助病毒互补的重组的反转录病毒质粒载体 构建: 从原病毒DNA上移去gag, pol, env等3个基因的全部或大部分序列, 保留下5‘-LTR, 3’-LTR以及pBS+ve, PBS+ve和包装位点psi. 然后加入选择标记基因构成重组载体. 标记基因的ATG要恰好插在gag基因的原来位置. ., * ., * 2、无需辅助病毒互补的重组的反转录病毒质粒载体 利用包装细胞株, 在它的染色体基因组DNA的某个位点整合有缺失了psi序列的原病DNA. 因此可以合成全部蛋白质,但不能包装自己的基因组, 而包装反转录病毒载体. ., * 利用动物转基因研究基因的表达与功能 目的： １基因导入动物受体细胞后在体内的表达调控特征以及相应的生物学效应 ２研究发育过程中相关基因的表达顺序，调控开关以及表达的时空特异性 ., * 利用转报告基因探测动物基因组的调控序列 作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件： (1)已被克隆和全序列已测定； (2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物； (3)其表达产物能进行定量测定。 ., * ＧＦＰ转基因动物 ., * ., * 报告基因(reporter gene) 一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因， 一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。 ., * ., * 世界上第一只成年体细胞克隆羊“多利” ., * 　　　　多利的基因母亲 普通白绵羊 乳腺细胞 细胞核 剔除了细胞核的苏格兰黑脸羊的卵子 　　科学家当时一共培育了277个胚胎，最后只有多利成功出生。体细胞克隆技术的低成功率，一直到现在也没有明显改