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层析技术基本原理 内容 ? 层析术语 ? 凝胶过滤层析 ? 离子交换层析 ? 疏水作用层析 ? 亲和层析 层析（Chromatography）的历史 液体输送系统 进样系统 层析柱 检测自动收集系统 1906 - Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919) 植物色素分离: 碳酸钙吸附剂/石油醚 3 / GE / 五大层析原理 Gel Filtration 分子筛 Ion Exchange 离子交换 Hydrophobic interaction 疏水层析 Reversed phase 反相 Affinity 亲和 O S O O 4 / GE / 重要的术语和参数 ? 分离体积 ? 分辨率 ? 选择性 ? 柱效 ? 对称性 ? 线性流速 ? 载量 5 / GE / 分离体积 ?VR ?Vo ?Vt ?Vc ?Vo = 外水体积 ?VR= 保留体积/洗脱体积 ?Vt = 总液体体积 ?Vi = 内孔体积/内水体积 ?Vc = 柱体积 ?Vs = 固相凝胶的体积 6 / GE / 分辨率：分离峰的能力 凝胶过滤可得到15个峰 反相液相峰 150个 ?0 ?10 ?20 ml ?0 ?200 ?400 ?ml 注意：我们不是在纯化峰，而是纯化生物分子 7 / GE / 分离系数Rs Rs = 0.6 Rs = 1 Rs = 4 Rs = V2 - V1 (W1 + W2) / 2 两峰相对于其峰宽而言, 分开的有多远 分辨率取决于选择性和有效性（柱效） 高选择性 选择性: ? 峰分离的量度 低选择性 ? 高选择性可以达到基线分离 ? 高选择性可以弥补低的柱效 - 峰体积有可能增加 有效性（柱效）: ? 峰宽的量度 高柱效 ? 柱效越高峰越窄 低柱效 ? 高柱效需要良好的柱填装技术 ? 高柱效有时可弥补选择性不足 峰展宽的影响因素 (轴向扩散） (传质阻力) (涡流扩散) 大分子 大颗粒 填装差不规则 小分子 小颗粒 填装好 流速 流速 流速 降低流速 不规则的填料 增加流速 涡流扩散 填料粒径分布 柱装填质量 流速对峰宽的影响 峰宽 传质阻力 涡流扩散 轴向扩散 流速 层析速率方程 ?H = Adp + B/u + Cdp2u H: 等板高度, dp: 粒径, u : linear flow 线速度 Adp: eddy , B/u: diffusion along column, Cdp2u : mass transfer 柱效测定方法 Vo Vs Vi 测试样品: 1% 柱体积丙酮（浓度1%）或者氯化钠 对称性As AU280 As = b a As =1 峰最好的形状 a b widths at 10% height As 1 峰拖尾 As 1 峰前倾 Vr AS ：0.8~1.5 可接受的范围 线性流速 线性速度： 流速 (ml/min) 柱高 (cm) 流体前沿沿柱管单位时间向下的 迁移距离(cm/hr) 线性流速 (cm/hr) = Flow (ml/min) x 60 2 Cross Area (cm ) 载量 (吸附层析) Flow 流速 Mass transfer Beads surface inner pores Bulk 填料表面和内孔 溶液主体 载量取决于: ? 蛋白性质 -分子量, 形状, 带电性, 疏水性等 ? 填料性质 -性质,粒径大小, 配基等 ? 操作条件 -pH, 盐浓度, 添加剂, 蛋白浓, 温度, 流速 内容 ? 层析术语 ? 凝胶过滤层析 ? 离子交换层析 ? 疏水作用层析 ? 亲和层析 18 / GE / 什么是凝胶过滤层析 凝胶过滤层析：是根据分子的大小来分离生物分子的 一种简单可靠的层析技术。 ? 根据大小和形状分离 ? 非吸附方式 ? 只需一种缓冲液 ? 容易操作 19 / GE / 凝胶过滤填料的结构 Agarose 琼脂糖凝胶 ? 孔内充满洗脱液 ? 孔径精密控制 ? 基架化学惰性，耐受常见 溶剂 ?cross-linked agarose ?dextran ? 基架具有一定的机械强度 ? 基架不能吸附生物分子 Cross-section from Superdex particle 20 / GE / 作用原理 1 2 3 4 1. 装填在柱子里的球状填料. 2. 上样. 3. 缓冲液携带着样品通过层析柱，分子在 填料孔径内来回扩散. 4. 大分子先流出层析柱，小分子后出. 出峰顺序 怎么去做 知道分子量大小和差异 目的物和杂质分子量差别一倍以上 ?mAU ?dimer ?1500 ?1000 ?monomer ?500 ?0 ?0.0 ?5.0 ?10.0 ?15.0 ?20.0 ?25.0 ?ml 怎么去做 选择合适填料 ?