- 1、本文档共39页,可阅读全部内容。
- 2、有哪些信誉好的足球投注网站(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
测序常见问题分析
主讲人:
张隽辉
1. 序列结构对测序的影响
图例:poly结构
原因:
主要原因是在polyT结构后,测序酶容易在模板上
滑动,导致随后的峰型变乱 或者移码
解决办法:
此类样品通过对其反向互补序列进行测序,通过 拼接可以得到模板全长序列.
图例:重复结构
原因:
重复结构会导致测序复制框的滑移,另外测序试剂采用
了I, U 代替G, T, 与模板结合能力较弱, 测序酶很难延伸,
信号会迅速衰减或峰谱很乱
解决办法:
使用反向引物对模板进行测序,测到重复序列反向互
补位置时,即可完成模板全长的拼接,一般测A\C重复
序列比G\T要容易一些
图例:回文结构
位点94至137碱基前后互补, 形成回文结构,该结构导致 后面的信号衰减,出现错误的判读。
图例: 特殊结构
现象: 信号在73bp(信号峰图2700处)突然中断,
测序PCR反应终止
原因:
变性后的单链在该处很可能互补或在全序列中有大的
特殊结构,造成严重的二级结构,使dNTP 和 ddNTP不
能和模板结合, 测序酶无法正常延伸
解决方法:
酶切,做亚克隆测序
2.测序常见图谱分析
图例:双克隆1
现象: T载体序列峰图正常, 连接位置处出现套峰
原因:
1.有插入片段的载体和空载体同时存在
2.PCR产物用T载体进行连接时,其片段能以正反两个方向
插入T载体
解决办法:
重新挑取单克隆
备注:
重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段, 并不足以证明模板的单一
图例:双克隆2
现象:
载体序列及插入片段前半部分峰图单一,套峰出现在插入片段中间
原因:
1. pcr产物不纯,且产物的引物结合区以及峰图单一的序列
都一样
2. 部分模板碱基发生突变,双峰出现的位点是由碱基突变
的位置决定的,有时会一端正常一端双峰(插入片断超过一
个反应测序长度(800~900bp)), 或者两个反应都双峰
解决方法:
重新挑单克隆
图例:非特异扩增
现象: 峰图起始即双峰
? 原因及解决方法:
? 1. 对于质粒样品, 引物在序列上有两个结合位点(载体上
和插入片段上),换一个引物测序
? 2.对于PCR产物,有两个模板,且两个模板都能和引物结合
扩增, 换引物或克隆测序
图例:等位基因双模板
现象:序列的80bp到120bp之间有两套峰存在,没有发生移码突变
解决方法:
采取克隆的方法将两套模板分开,分别进行测序
图例:碱基缺失
碱基缺失常见在PCR产物中,特别是从基因组中扩增得到的PCR片段,
上图的186位缺失两个连续的T。
解决方法:
1)使用反向引物继续测序,以矫正缺失位点并达到测通的目
的。或者将该PCR产物克隆到质粒中,挑取单克隆测序。
2) 如果可以确定该PCR片段中不应该有缺失的位点,那么可
以改变PCR反应条件,重新扩增。
图例:PCR产物有小片段
在197bp前表现为明显的套峰,且在197bp位置有一个高高的A
峰,这个A峰是测序进行到片段最后一个碱基的标志, 推断出产物
中有一个大小约为220bp左右的片段。
解决方法:对PCR产物切胶纯化,再进行测序。
图例: 引物不纯
现象: 杂峰非常有规律,每个主峰下的小峰都是后一个碱基的主峰
原因:
部分引物比正常的引物在5’端少一个碱基, 导致移码双峰
解决方法:
重新合成引物,或者将引物进行PAGE纯化后再进行测
序。
图例:染料峰 不合格
图例:染料峰 可认为合格
图例:残留盐分过高 Raw data峰
图例:残留盐分过高 sequencing峰
现象:Raw date峰基线漂移, sequencing峰前面干扰
严重, 后面正常
? 原因: 产物中残余的盐离子浓度过高影响毛细管电渗
? 解决方法: 优化PCR条件,降低buffer使用浓度
图例:无反应sequencing峰
图例:无反应Raw data峰
? 无反应可能原因:
? 1. 模板浓度过低
? 2. 引物结合温度比测序反应的退火温度低
? 3.没有引物结合位点
? 4.产物中含有抑制测序酶活性的物质
3.送样注意事项
送样要求(测序样品及引物)
模板参考量
送样注意事项
我公司提供Amp,Kan,Cm,Tc四种抗生
素和LB、2YT两种培养基以及37℃培养温
度,其它抗生素类型请随同样品一起备齐,
并标明工作浓度;其它培养基请自备,特殊
培养条件请注明!
?样品名命名规则:
由于有些符号系统不识别,会影响测序结果的发送
成,建议您用字母、数字和“-”组成,系统会自动将特
殊字符(\,/,:,*,?,,,|)等转换成“_”,请注意!
?E-MAIL:
为使测序结果顺利发送到您的邮箱, 建议采用容量大的
163或126信箱,邮箱地址请用大写字母填写, 同时注
意区分数字0和字母O、
您可能关注的文档
- 测绘成果质量管理制度(整理版).doc
- 草鱼的营养与实用饲料配方技术.doc
- 测绘师综合指标统计(背诵版).doc
- 测距仪lm50使用说明书.doc
- 测量不确定度评定步骤.doc
- 曹禺戏剧的辉煌与衰落——曹禺的戏剧观与他的戏剧生涯.doc
- 测井曲线的自动识别与提取.doc
- 测量实习报告11.doc
- 测量不确定度的评估.doc
- 测量数据处理理论与方法2.doc
- 2024年证券分析与咨询服务项目投资申请报告代可行性研究报告.docx
- 2024年铬酸酐项目资金申请报告代可行性研究报告.docx
- 2024年清洁胶项目资金申请报告代可行性研究报告.docx
- 2024年肉松饼项目投资申请报告代可行性研究报告.docx
- 2024年陆上泵项目资金需求报告代可行性研究报告.docx
- 2024年未硫化复合橡胶及其制品项目资金需求报告代可行性研究报告.docx
- 2024年精密温控节能设备项目资金筹措计划书代可行性研究报告.docx
- 2024年汽车覆盖件模具项目资金筹措计划书代可行性研究报告.docx
- 宋词行书钢笔字帖.pdf
- 我的暑假生活作文三年级300字10篇.pdf
文档评论(0)