5全版.1基因工程制药全版.ppt

基因工程重组药物宿主的选择主要考虑产物的活性表达和宿主的安全性。 一般的原则是根据所用的载体体系及各种受体细胞的基因型进行选择，要使重组体的转化或转染效率高、能稳定传代、受体细胞基因型与载体所含的选择标记需匹配。 （一）宿主细胞的选择 ., * 1、原核细胞 2、真核细胞 （1）大肠杆菌：目前采用最多的原核表达体系。 （2）枯草芽孢杆菌 （3）链霉菌 （1）酵母：酿酒酵母应用广泛。 （2）丝状真菌 （3）哺乳动物细胞 （4）植物细胞 ., * （二）大肠杆菌中的基因表达 1、载体 表达载体必须具备的条件： （1）载体能够独立的复制 （2）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记 （3）具有很强的启动子 （4）具有阻遏子 （5）有很强的终止子 （6）有翻译的起始信号 ., * 常用的表达载体： （1）pBV220系统 （2）pET系统 ., * 2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 （1）外源基因的拷贝数 （2）外源基因的表达效率 （3）表达产物的稳定性 （4）细胞的代谢负荷 （5）工程菌的培养条件 ①启动子的强弱 ②核糖体结合位点 ③SD序列和起始密码子ATG的间距 ④密码子组成 ., * 3、真核基因在大肠杆菌中的表达形式 （1）以融合蛋白的表达形式表达药物基因 由一段短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的蛋白质，称为融合蛋白。 （2）以非融合蛋白的形式表达药物基因 （3）分泌型表达蛋白药物基因 ., * 1、载体 （1）载体的复制序列——包括YEp类、YRp类、YRp类和YIp类。 （2）克隆载体——由于从大肠杆菌中制备质粒比从酵母中容易，所以酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的。 （3）表达载体——包括普通表达载体和精确表达载体。 （三）酵母中的基因表达 ., * 2、影响目的基因在酵母菌中表达的因素 （1）外源基因的拷贝数 （2）外源基因的表达效率 （3）外源蛋白的糖基化 （4）宿主菌株的影响 表达用的酵母宿主菌应具备： ①菌体生长力强。 ②菌体内蛋白酶要较弱。 ③菌株性能稳定。 ④ 分泌能力强。 主要与启动子、分泌信号和终止序列有关。 ., * （四）动物细胞中的基因表达 中国仓鼠卵巢细胞（CHO） 猴肾细胞（COS） CHO细胞属成纤维细胞，该细胞缺乏二氢叶酸还原酶（DHFR），经转染可将DHFR重组至细胞中，含有DHFR表达载体的重组CHO细胞，经氨甲喋呤（MTX）培养筛选后可选择出克隆表达异源基因的重组细胞。 哺乳动物细胞表达外源基因的主要优点 ——能识别和剪切外源基因中的内含子并加工为成熟的mRNA。 ., * 主要载体 SV40衍生载体 逆转录病毒载体 腺病毒载体（AV） 腺相关病毒载体（AVV） 痘苗病毒载体（VV） ., * 三、基因工程菌的稳定性 基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，又分为分裂不稳定和结构不稳定。分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。 ., * 质粒稳定性的分析方法： 1、质粒不稳定产生的原因 主要与两个因素有关： 一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率； 二是这两种菌的生长比速率差异的大小。 ., * 二阶段培养法：第一阶段先使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。 2、提高质粒稳定性的方法 ., * 第三节 基因工程药物的生产 ., * 一、基因工程药物的生产特点 是外源蛋白在宿主细胞内的异源表达，不同于微生物的天然次级代谢药物，因此在调控合成方式上，应该主要受限于质粒或噬菌体的内在性质； 是蛋白质产物，不同于种类多样的次级代谢产物； 合成途径简单，没有复杂的多酶系统； 产物的积累主要在胞内，分泌型也主要积累在细胞周质中； 产物在胞内积累通常是以内涵体的形式； 分离纯化相对于次级代谢产物而言要简单、一致； 产物分离纯化后可能没有活性，需要进一步的复性。 ., * 基因工程药物是转基因产品，具有潜在的危险，因此对产生菌的管理要求严格，应该避免各种可能的扩散污染，必须在合格的GMP生产车间进行。 基因工程药物的GMP是对生产全过程的质量管理，涉及人员、厂房、设备，原材料采购入库、检验、发料、加工、制品及半成品检验、分包装，成品检定，产品销售、运输，用户意见及使用反应处理等在内的全过程的质量管理。 ., * 二、基因工程菌发酵 基因工程菌的培养过程主要包括： （1）通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分拆表达产物的合成、积累对受体细胞的影响； （2）通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案以及顺序。 ., * 1、基因工程菌的培养方式 常用的有：补料分批培养、连续培养、透析培养、固定化培养。 ., * （1）补料分批