pcr实验室污染与对策.doc

P CR实验室的污染与对策 河北医科大学第三医院 冯忠军 P CR技术是一种体外模拟自然DNA复 制过程的核酸扩增技术，该技术通过 重复高温变性、低温退火、中温延伸 等简单的3个温度循环，能将靶DNA扩 增数百万倍，获得极高的检测 敏感性。 30次循环后靶序列扩增的数量 No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 1 cycle = 2 Amplicon 2 4 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 3 8 4 cycle = 16 Amplicon 4 16 5 cycle = 32 Amplicon 5 32 6 64 6 cycle = 64 Amplicon 20 1,048,576 7 cycle = 128 Amplicon 30 1,073,741,824 Mul l i s 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文 中写到: “这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝 DNA片段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行 驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来 的”。 P CR发展速度惊人，没有一种技术能与之相比 引用论文最多、应用范围十分广泛。 P CR专利官司斗争不断也是基于其带来的巨大 的效益。 最令人头痛的问题是易污染，极其微 量的污染即可造成假阳性的结果。 如果形成气溶胶污染而扩散，则可引起 整个P CR实验室的污染。 处理方法：极其麻烦，甚至要关闭P CR 实验室。 难忘的1995年-------被称之 为PCR临床检验爆炸年？ 天下大乱！ 到天下大治！ 某实验室污染的经历 某实验室曾经遭遇过气溶胶的污染，所 幸的是经过一段时间的处理，最终将P CR实 验室污染排除掉了。 （一）实验室情况 l 实验室设置 实验室分为试剂准备区、标本制备区、扩增 区三个区，试剂存放在试剂准备区，标本是在标 本制备区处理，处理完的标本置于扩增区上机扩 增。 l 使用试剂 试剂是由国内某公司提供的乙型肝炎病毒 ( HB V) 荧光定量P CR试剂。证件齐全，符合国家要 求。 l 操作人员 经过卫生部临检中心组织的理论和操作培训 并通过考试取得合格证。 （二）污染的发现 2004年8月12日，该实验室按正常的操 作规程检测HBV DNA标本，同时设立了阴性 对照和阳性对照( 均为试剂盒中配备) ，扩 增结束分析结果时，发现HBV DNA所有的标 本及阴、阳性对照均为阳性，提示操作过 程中出现污染，但具体是什么原因引起的 污染还不清楚。 （三）污染源的追踪 出现污染后，工作人员首先考虑可能是 试剂的污染，更换新批号的HB V试剂重新检 测后，结果仍然为全部标本阳性。 将HB V标本拿到其他正规的P CR实验室检 测，结果标本中阴、阳性结果都有，阴性 对照是阴性，阳性对照是阳性，说明标本 没有被污染。 将两种批号的HB V试剂拿到其他规范的 P CR实验室检测，显示试剂没有问题。 该实验室用消毒液擦拭工作台面 后，打开所有的紫外灯照射一天，将 所使用微量进样器、离心管、枪头、 手套、记号笔、记录本等都更换掉， 再将HB V标本进行检测，结果全部标本 仍然为阳性。 第2天，仍然用消毒液擦拭工作台 面后，再打开所有的紫外灯照射一天， 将HB V标本重新检测，同时设置了两个 阴性对照( A和B) 。 A对照：打开试剂反应管的盖 子，在空气中暴露10 mi n，盖上盖 子，上机检测； B对照：试剂的反应管不开盖 子，直接上机检测。 结果：全部标本和A对照为阳 性，而B对照为阴性。 至此，虽然还查找不到污染源是什么， 但有一点可以肯定，P CR实验室污染是气溶 胶扩散而引起的。 经过调查，发现污染是由于该实验室新 来了一个清洁工人，没有经过培训就直接上 岗，在打扫实验室卫生时，用扩增区的扫笤 和拖把打扫了标本制备区的卫生引起。 （四）污染的排除 在确定了污染的原因后，工作人员就开始着 手排除污染，每天都打开整个P CR实验室的门窗和 排气扇，让整个实验室通风，用消毒液擦拭整个 P CR实验室，打开所有的紫外灯照射。 每隔3天按上述步骤检测一次，一直这样处理 了一个多月，A阴性对照才转为阴性。 连续检测3次A和B阴性对照, 每次结果都均为 阴性, 才确定P CR实验室恢复正常。 （五）体会 P CR强大扩增能力+检测的敏感性 l 经30个周期后，特定DNA片段的数量在理论上可增 加109倍 l 极微量的污染便可导致假阳性，尤其对定量造成 很大的问题 l P CR实验过程中，防止污染是很重要的一个工作。 应注意防止反应体系被痕量DNA模板污染和交叉污 染，这是造成假阳性最大的可能。 开始