核酸分子杂交技术概述.ppt

二、影响杂交的因素 1 、核酸分子的浓度和长度： 浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在 0.1~0.5μg, 浓度过高影响杂 交效率 2 、温度： （ 1 ） DNA/DNA 杂交，适宜温度较 Tm 值低 20~25 ℃ （ 2 ） RNA/DNA 或 RNA/RNA 杂交，加甲酰胺降低 Tm 值 （ 3 ）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较 Tm 值低 5 ℃ 3 、离子强度： （ 1 ）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂 交率增加 （ 2 ）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进 行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交 反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度 4 、甲酰胺： （ 1 ）甲酰胺能降低核酸杂交的 Tm 值，能降低杂交 液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待 测核酸与探针同源性不高时，加 50% 甲酰胺溶液在 35~42 ℃杂交 （ 2 ）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶 液在 68 ℃杂交 5 、核酸分子的复杂性： （ 1 ）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序 的总长度 （ 2 ） Cot? 与反应体系中核酸复杂性成正比 （ 3 ）两个 DNA 样品浓度绝对一致时，变性后的相对 杂交率取决于 DNA 的相对复杂性 6 、非特异性杂交反应： （ 1 ）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针 的非特异性吸附 （ 2 ）常用的封闭物有两类：即非特异性 DNA 和高分 子化合物。如鲑精 DNA 或小牛胸腺 DNA ， Denharts 溶液或脱脂奶粉 三、 核酸分子杂交的方法 按待测核酸是否固定在固相支持物上分： ? 固 - 液相杂交 膜上印迹杂交 原位杂交 ? 液相杂交 RNA 酶保护分析法 核酸酶 S1 保护分析法 带有 DNA 片段的凝胶 DNA 分子 限制片段 限制性酶切割 琼脂糖电泳 至 膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜） 上 转膜 杂交、显影 凝胶 滤膜 用缓冲液转移 DNA 吸附有 DNA 片段的膜 Southern 印迹杂交的技术流程 （一） Southern 印迹杂交 1 、待测核酸样品的制备 （ 1 ）裂解或破碎细胞 （ 2 ）抽取纯化基因组 DNA （ 3 ）限制酶消化 DNA 为大小不同的 DNA 片段 2 、待测 DNA 样品的电泳分离 （ 1 ）琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 （ 2 ）凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA 泳动慢 , 小分子 DNA 泳动快， 大小 相同的分子处于同一条带 （ 3 ）分子量标准：经 Hind Ⅲ 消化的 λDNA ，杂 所用分子量标准可用核素标记 3 、凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于 NaOH 溶液中使 DNA 变性断裂为较短的 单链 DNA, 中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液 4 、 Southern 印迹 指将电泳分离的 DNA 片段转移到一定的固 相支持物上的过程。 （ 1 ）固相支持物的选择 理想的固相支持物应具备的特性： ①具有较强结合核酸分子的能力 ②不影响与探针的杂交反应 ③与核酸分子结合稳定牢固 ④具有良好的机械性能 ? 非特异吸附少 常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是 DNA 分子结合不牢固