第十章 植物种质的超低温保存.ppt

第十章 植物种质的超低温保存 种质保存的概念 ? 种质保存：利用天然或人工创造的适宜环 境 保存种质资源 ，使个体中所含有的 遗传 物质保持其完整性 ， 有高的活力 ，能通过 繁殖将其遗传特性传递下去。 种质保存的途径 ? 种子保存：种子生活力逐渐下降；易受病虫鼠 害侵扰。 ? 种植保存：占地多，管理费用高。 ? 离体（组织培养）保存：不断继代培养可能导 致培养物的染色体和基因型的变异；费用较高 ? 超低温冷冻保存：在液氮超低温下保存种质的 技术。应用前景广阔。 一、离体保存方法 ? 使保存种质处于缓慢生长或无生长状态， 需要时可迅速恢复生长。 ? 抑制生长的方式： – 降低温度 – 降低环境中的氧含量 – 使用生长延缓剂 – 其它方法 离体种质保存的优点 ? 占用空间少，节省人力 、物力和土地； ? 便于种质资源的交流利用； ? 需要时，可以利用离体培养方法很快大量 繁殖； ? 避免自然灾害引起的种质丢失。 二、超低温冰冻保存技术 （一）原理 ? 原理：液氮中几乎所有的细胞代谢活动、 生长都停止了，因而排除了遗传性状变异 的可能性，达到长期保存植物种质的目的 。 ? 在超低温储藏中，植物材料不仅能长期保 持形态发育的潜能，还能保持遗传性状的 稳定，是迄今唯一不需要继代的、可靠的 长期保存方法。 （二）关键问题及解决措施 ? 关键问题：在超低温条件下，冰冻过程中避免细 胞内水分结冰，解冻过程中防止细胞内水分次生 结冰。 ? 解决措施： – 选取细胞内自由水少、抗冻力强的植物材料； – 采取预处理措施，提高植物的抗冻力； – 在冷冻和解冻过程中尽量减少冰晶的形成； （三）基本程序 ? 1 、材料的选择： – 组织、细胞特征：细胞分裂旺盛、体积小、原 生质浓厚的分生细胞或组织； – 培养时期：旺盛的对数生长期（抗冻力和存活 率高） – 大小：适宜 （三）基本程序 ? 2 、材料的预处理 – 处理目的：减少细胞内自由水的含量，使细胞 经受低温锻炼，以提高组织或细胞的抗冻能力 。 – 处理方法： ? 低温锻炼 ? 预培养，加入提高材料抗冻能力的物质（如 DMSO 、蔗糖） （三）基本程序 ? 冰冻保护剂 0 ℃ 预处理 ? 如何选择冰冻保护剂：易溶于水；适当浓 度下对细胞无毒害；化冻后容易从组织细 胞中清除。 ? 常用的冰冻保护剂： DMSO 、甘油、糖、 PEG 等。 （三）基本程序 ? 3 、降温冰冻操作 – 1 ）直接快速冷冻 – 2 ）分级冰冻法 – 3 ）玻璃化法 – 4 ）干燥冷冻法 – 5 ）包埋冻存法 快冻法 ? 0℃（或其它预处理温度） 直接进入液氮 。 ? 降温速度：每分钟1000 ℃以上。 ? 适用对象： –高度脱水的植物材料，如种子、花粉、球茎、 块根等。 –抗寒性较强或经过低温锻炼的植物，如某些木 本植物的枝条或芽。 分级冷冻法 ? 适用对象：不抗寒的植物或含大液泡和大 量水分的成熟材料（包括悬浮培养的细胞 等） ? 程序降温仪 起始温度 0.1-10 ℃的 降温速度 -70 ℃~ -40 ℃ 液氮 两步冷冻法 转移温度 分级冰冻法 ? 逐级冰冻法：将经保护剂处理的材料在 0 ℃ 预处理后，依次通过不同温度的冰冻，如 -10 ℃ 、 -15 ℃ 、 -23 ℃ 、 -40 ℃ 等，一般每 级约停留 5min ，然后学好入液氮。