实验九 细胞骨架观察.doc

实验九 细胞骨架观察（4学时） 一、实验目的 掌握植物细胞骨架的结构特征及其制备技术。 二、实验原理 细胞骨架（cytoskeleton）是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构，按组成成分和形态结构的不同可分为微管（MT，20－25nm）、微丝（MF，5－7nm）和中间纤维（IF，8－11nm）。它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。光学显微镜下细胞骨架的观察多用1% Triton X-100处理细胞，可使细胞膜和细胞质中的蛋白质和全部脂质被溶解抽提掉，而细胞骨架系统的蛋白质不受破坏被保存，经戊二醛固定，考马斯亮兰R250染色后，微管不够稳定，其他类型纤维太细，无法分辨，只能观察到由微丝组成的微丝束（40nm）为网状结构。 三、实验仪器、材料和试剂 （一）仪器、用具： 光学显微镜，镊子，剪刀，试管，表面皿，滴管，载玻片，盖玻片，染色缸，烧杯。 （二）材料：新鲜洋葱鳞茎 （三）试剂 1） M缓冲液（pH 7.2）： 　　　　50mmol/L咪唑(MW:68.08，3.4g/L) (缓冲剂) 　　　　50mmol/L KCl(MW:74.55, 3.73g/L) 　　　　0.5mmol/L MgCl2·6H2O(MW:203.30, 0.1g/L)或MgCl2(MW:95.3, 0.05g/L) 　 1mmol/L EGTA(MW:380.36, 0.38g/L) （和EDTA敖合Ca2＋，并在Mg2＋存在时，骨架纤维保持聚合状态并较为舒张） 　　　　0.1mmol/L EDTA (MW:292.25, 0.29g/L)或EDTA·Na2（MW:372.24,0.37g/L） 　　　　1mmol/L DTT(MW:154.3, 0.15g/L) 用1M HCl调至pH7.2 　　2） 0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）（pH7.3）： PB 50ml NaCl 0.15M 蒸馏水 至1L 100ml 0.2 M磷酸缓冲液（PB）（pH7.3）：0.2 M Na2HPO4 77ml 0.2 M NaH 　 0.2 M Na2HPO4：Na2HPO4·2H2O（MW：178.05，3.561 g/100mL）或Na2HPO4·12H2O（MW：358.22， 0.2 M NaH2PO4： NaH2PO4·H2O （MW：138.01，2.76 g/100mL）或NaH2PO4·2H2O（MW：156.03， 3）1% Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 溶于M-缓冲液 4）3% 戊二醛100mL: 取50% 戊二醛6mL ,PBS 94mL 5） 0.2% 考马斯亮蓝R250染液： 　　　　　　考马斯亮蓝R250 0.2g（0.04g/20mL） 　　　　　　甲醇 46.5mL（9.3ml/20mL） 　　　　　　冰乙酸 7mL（1.4ml/20mL） 　　　　　　蒸馏水 46.5 mL（9.3ml/20mL） 四、实验方法与步骤 （1）撕取洋葱鳞茎内表皮(约l cm2大小若干片)置于装有pH7.3 磷酸盐缓冲液的50m1烧杯中，使其下沉。 （2）吸去磷酸盐缓冲液，用1％Triton－l00处理20—30min。 （3）吸去Triton－l00，用M缓冲液洗3次，每次10min。 （4）3％戊二醛固定0.5—1h。 （5）pH7.3磷酸盐缓冲液洗2次，每次10min。 （6）0.2％考马斯亮蓝R250染色20一30 min。 （7）用蒸馏水洗1—2次，细胞置于载玻片上，加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。 五、结果 六、作业： 绘图示细胞骨架的形态