实验四 酸性磷酸酶Km及Vmax值测定PPT参考课件.ppt

酸性磷酸酶Km及Vmax值测定清洗试管24支 * 酸性磷酸酶： 催化磷酸单酯的水解反应 存在于人的肝脏，前列腺等处 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。 是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测指标。 一、概述 * 酶液 磷酸苯二钠 苯酚 ＋ 磷酸氢二钠 folin-酚测定酚的浓度 计算出反应速度（用产物生成量/min来表示） 根据双倒数法计算出Km及Vmax 二、实验原理 * * V= Vmax [S] [S] Km + * 三、实验步骤： 1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 3、制作酚标准曲线 4、[S]与V0关系实验 5、双倒数作图法计算Vmax和Km * buffer substrate enzyme Certain Time blank Stop the reaction Color developed * 生化实验课老师：于晓虹 实验报告请交到讲台上来 酶液稀释　　取上清液３００微升，稀释３０倍，用大试管装 科代表　　李博恒 * 1、磷酸酶原液的制备： 称取5g绿豆芽茎（去头去根），加入pH5.6的HAC缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟。纱布过滤，取1.8ml滤液,以6000rpm，离心20min，取上清。 上清液用pH 5.6的HAC缓冲液稀释30倍，用于实验。 * 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 （目的：选取合适的反应时间） * 加 液 程 序 表 管号 1 2 3 4 5 6 0 磷酸苯二钠 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 酶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 精确反应时间 3 5 10 15 20 25 碳酸钠溶液 2 2 2 2 2 2 2 酶液 － － － － － － 0.5 Folin－酚溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Folin－酚溶液已稀释好！ 注： 进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始 35℃保温10分钟 * 0 1 2 3 4 5 6 反应时间 0 3 5 10 15 20 25 吸光度 结果： 以反应时间为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制反应进程曲线，并从该曲线上求出酸性磷酸酶反应初速率的时间范围。 * 3、制作酚标准曲线 （目的：可从酚标准曲线上查出A680nm所相当的酚含量,并计算出反应速度（用每分钟产物生成量来表示） * 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0.4mM phenol standard solution 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 H2O 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 1M Na2CO3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Folin-phenol reagent 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 加 液 程 序 表 35℃保温10分钟 *