变性梯度凝胶电泳PCRDGGEnew 课件.ppt

变性梯度凝胶电泳 —— 从实验到分析 2019 年 9 月 X 日 变性梯度凝胶电泳 (denatured gradient gel electrophoresis ， DGGE) 最初是 Lerman 等人于 20 世 纪 80 年代初期发明的，起初主要用来检测 DNA 片 段中的点突变。 Muyzer 等人在 1993 年首次将其应 用于微生物群落结构研究 。后来又发展出其衍生技 术，温度梯度凝胶电泳（ temperature gradient gel electrophoresis ， TGGE ）。此后十年间，该技术被 广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前 已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物 学方法之一。 变性梯度凝胶电泳 (DGGE) 变性梯度凝胶电泳（ DGGE ） : 一种分离相似大小 DNA 片段 的电泳方法。即双链 DNA 在变性剂 ( 如尿素或甲酰胺 ) 浓度或 温度梯度增高的凝胶中电泳，随变性剂浓度升高，由于 Tm 值不同， DNA 的某些区域解链，降低其电泳泳动性，导致 迁移率下降，从而达到分离不同片段的目的。 由于各类微生物（如细菌和古细菌）的 16sRNA 基因序 列中可变区的碱基顺序有很大的差异，其中不同土壤微生 物的 16sRNA 基因的 V3 区扩增的 DNA 片断在 DGGE 中的应用最为 广泛，根据电泳条带的多寡和条带的位置可以初步辨别出 样品中微生物的种类多少，粗略分析土壤样品中微生物的 多样性。 变性梯度凝胶电泳 (DGGE) 环境样品基因组 DNA 的提取 目标片段的 PCR 扩增 DGGE 图谱的分析 图像的采集和条带的回收 DGGE 分析 电泳前准备工作 电泳分析 剥胶、染色 DGGE 条带测序 DGGE 分析微生物群落的主要步骤 ? 总 DNA 的提取是 DGGE 研究微生物群落的基础。适合 的 DNA 提取方法对环境样品微生物群落结构分析非常 重要。 ? 适合 DNA 提取方法的考量：① DNA 的得率。②能否 进行 PCR 扩增以及扩增的重复性。③制备 DNA 花费时 间的长短。 ? 关于 DNA 提取的建议： 优先考虑基于原位裂解的方法，根据实际情况采用 酶解 / 酚氯仿抽提法，或者 DNA 提取试剂盒（建议购 买 Qiagen 公司相关产品） 。 环境样品基因组 DNA 的提取 ? 选择适合的目标片段， 设计合适的引物，注意 有 GC 夹子情况下引物 二聚体的行程。 ? 环境样品目标片段的扩 增最好采用 Touch down PCR 。 ? 注意 PCR 的环境， V3 区 产物扩增极易污染。 目标片段的 PCR 扩增 细节决定成败！ DGGE 分析 ? 从这一步开始，带上手套。 ? 配置试剂时一定要用去离子水，可以配置不同梯度的变 性溶液备用，注意变形溶液中大颗粒的过滤及脱气。 ? 制胶洗膜时用的各个容器要用去离子水洗涤干净，以防 止氯离子污染。 ? 灌胶前准备好所有需要的东西，试剂、枪头，甚至物品 摆放的位置。 ? 制胶是实验的关键，在往玻璃板中灌胶时要匀速地转动 滑轮，将凝胶液匀速地灌入玻璃板。 ? 灌胶后立刻清洗注射器，以防丙烯酰胺凝固，堵塞管子。 DGGE 前的准备工作 DGGE 制胶主体部件： ? 上样的胶孔要用去离子水冲洗干净并吸干。 ? PAGE 胶装入电泳支架时注意用去离子水润滑橡胶垫。 装入后在胶孔中加入缓冲液。 ? 上样时上样器要深入胶孔底部。 ? 尽量在同一个胶上比较所有样品，每一个胶上要有 marker lane 。 ? 将胶放入电泳槽中时注意正负极。 ? 建议低电压电泳一段时间，在样品完全进入胶中之 后再升电压。 电 泳 ? 停止电泳后注意把电泳仪调 零之后在关闭电源 ? 剥胶需要细致，用好去离子 水和保鲜膜。 ? 染色前做好胶样品顺序的标 记。 ? 银染、 EB 染色和 SYBRGreen 染色。 剥胶与染色 ——垂直电泳 凝胶变性梯度的确定 关于 PCR 产物的纯化和定量 关于 DGGE marker 的制作 ? 获得高质量的 DGGE 图谱。 ? DGGE 条带的回收 －－注意紫外条件下操作的安全。 －－尽量减少 DNA 在紫外下的照