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重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体
外源性DNA残留量测定法(qPCR法)
1原理
实时定量PCR(qPCR)扩增分2个阶段,指数增长阶段和之后出现的非指数平台阶段。在指数增长阶段,每个循环PCR产物量大约增加一倍。然而,随着反应的进行,反应体系组成成分的消耗,其中的一种或多种成分限制反应,产物增长速度变慢,反应进入平台期。
反应最初,虽然产物呈指数增长,但是荧光处于背景水平,检测不到荧光增加。但积累了足够的扩增产物,才可检测到的荧光信号,这个循环数叫初始循环数,即CT。CT值主要由扩增反应体系中模板的初始浓度决定的。如果模板初始浓度高,只需要较少的扩增循环就可以积累足够的产物,产生高过背景的荧光信号,因此,反应就有一个小或早出现的CT;相反,如果模板初始浓度低,需要较多的扩增循环才能产生高过背景的荧光信号,反应就有一个大或迟出现的CT。两者之间关系的建立是qPCR用于定量的依据。
2主要仪器
表2 仪器信息表
名 称
厂 家
型 号
实时定量PCR仪
Bio-Rad
CFX Connect
3主要试剂
表3 试剂信息表
名 称
厂 家
规 格
残留DNA样品制备试剂盒
ABI
Lysis Buffer,2 bottles,50ml/bottle;
Binding Solution,1 empty bottle;
Wash Buffer Concentrate, 2 bottles, 26 ml/bottle;
Elution Buffer; 1 bottle, 25ml;
Proteinase K (PK) Buffer, 1 bottle, 50ml;
Magnetic Particles, 2 tubes, 1.5 ml/tube;
Proteinase K, 2 tubes, 20 mg/ml, 1.25 ml;
Yeast tRNA, 2 tubes,10mg/ml,0.5ml;
Glycogen, 2 tubes,5mg/ml,1.0ml/tube.
残留DNA定量检测试剂盒(CHO)
ABI
DNA Control,1 bottle,40μl;
DNA Dilution Buffer(DDB),1 bottle,7ml;
2×Environmental Master Mix, 2 tubes,0.75ml/tube;
10×DNA Resl-Time PCR Assay Mix, 1 tube,300μl;
5) Negative Control, 1 tube,1.0ml.
4溶液配制
4.1 蛋白酶K混合液(新配)
附件13-14
附件13-14重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体外源性DNA残留量测定法(qPCR)
1 reaction
(100μl/sample)
10 reaction
(100μl/sample)
Proteinase K
10μl
100μl
Proteinase K Buffer
60μl
600μl
4.2 裂解混合液(新配)
试 剂
体 积(μl)
Glycogen(5mg/ml)
180
tRNA(10mg/ml)
4
Lysis Buffer
7600
合 计
7784
4.3 DNA标准品稀释
Tube label
Dilution
pg/μl
pg/ reaction
DNA Control
30000
300000
SD1
10μl DNA Control+990μl DDB
300
3000
SD2
50μl SD1+450μl DDB
30
300
SD3
50μl SD2+450μl DDB
3
30
SD4
50μl SD3+450μl DDB
0.3
3
SD5
50μl SD4+450μl DDB
0.03
0.3
SD6
50μl SD5+450μl DDB
0.003
0.03
NTC
DDB
0
0
注:DNA标准品溶液4℃放置保存1天,-20
5测定方法
5.1样品处理
5.1.1
1)在2ml离心管中加入100μl样品;
每100μl的样品中加入70μl的蛋白酶K混合液,混合均匀,56℃
每100μl的样品中加入360μl的裂解液,室温裂解2小时以上。
5.1.2
1)磁珠使用前于37℃
2)每100μl的样品加入30μl的磁珠悬浮液;
3)每100μl的样品加入300μl的Binding Solution,涡旋混合5min;
4)12000r/min离心30sec,将离心管放置于磁力架上,静置5min直至溶液清澈,弃上清;
5)从磁力架上取下离心管,加入300μl的Wash Buffer,涡旋混合5 sec;
6)12000r/min离心30sec,将离心管放置于磁力架上,静置2min,弃上清;
7)重复步骤6)
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