酶类药物PPT参考幻灯片.ppt

* 4、SOD的性质 对热稳定：天然牛血SOD可75℃加热数分钟，对热稳定性与溶液离子强度有关 对pH的稳定性：一般pH5.3~9.5较稳定，猪血SOD在pH7.6～9较稳定 金属辅基与酶活性关系 Cu、Zn-SOD：Zn与分子结构有关，与催化活性无关 Cu与活性有关，对酶活力是必需的 Mn-SOD：Mn对酶活力是必需的 Fe-SOD：Fe对酶活力是必需的 * 5、SOD的制备 * 提取工艺要点： 溶血液制备 ：新鲜牛血以3.8%柠檬酸钠抗凝,血球分离机分离红细胞,加2倍无离子水,搅拌溶血30 min. 选择性热变性：溶血液泵入夹层反应釜,搅拌、蒸汽加热至68℃,加入适量蛋白质沉淀剂使血红 蛋白完全变性后,将反应液泵入冷却罐,搅拌机搅拌,迅速冷却至15℃,按反应液总体积补加适量蛋白质沉淀剂,搅拌1 h,甩干过滤去除变性血红蛋白,过滤液3000rpm 20min低速离心,去除颗粒沉淀物. 超滤浓缩：上清液经微孔过滤去除细微颗粒,经超滤器超滤浓缩至总体积的1/200,收集浓缩液. 丙酮沉淀： 超滤浓缩液预冷至4℃,加入等体积预冷的工业丙酮,放置1h,4000rpm 30min冷冻离心,沉淀用少量无离子水回溶,对无离子水透析12h,4000rpm 30min冷冻离心,收集上清液. 柱层析 ：经处理的DEAE-52装柱,用2.5mM/L 缓冲液平衡,缓慢上样,用梯度洗脱,收集SOD部分,对无离子水透析12h. 冷冻干燥 透析后的酶液经浓缩,置冻干机内冷冻干燥,升温速率控制在5℃/h. * 6、SOD的检测 SOD酶活力测定 采用邻苯三酚自氧化法,25℃自氧化速率0.07,pH8.2 ,50mM Tris-HCl缓冲液. 蛋白质浓度测定 采用Lowry法,以250μg/ml BSA作标准曲线. 分子量测定 采用SDS电泳法,浓缩胶3.5%分离胶10%. 紫外吸收光谱检测 扫描波长范围230~300 nm. * 溶菌酶（lysozyme） 1、概述 （1）溶菌酶（又称胞壁质酶、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶）是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。 （2） 20世纪初，英国细菌学家弗莱明（Flemin）在发现青霉素的前6年（1922年）发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶。 。 * （3）性质： 其纯品为白色或微黄、黄色的结晶体或无定型粉末，无异味，微甜，易溶于水，遇碱易被破坏，不溶于乙醚， 溶菌酶由129个氨基酸残基组成的碱性球蛋白， 等电点在pH10.8左右， 分子量为14000， 化学性质非常稳定，当PH值在1.2-11.3的范围剧烈变化时，其结构几乎不变， 在酸性环境下，溶菌酶对热的稳定性很强，pH4.0- 7时，100 ℃处理1min仍能保持原油酸活性；pH值低于4时，能耐100℃加热处理， 在空气湿度较低时，溶菌酶可以长期在室温下存放。 　　 * 2、溶菌酶的制备 * 胰蛋白酶（Trypsin） 1、概述 胰蛋白酶系自牛、羊或猪胰中提取的一种蛋白水解酶。 白色或米黄色结晶性粉末。 溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。 分子量24 000， pI 10.5，最适pH值7.8～8.5左右。pH9.0不可逆失活。 * 2、临床应用　 能选择地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，能消化溶解变性蛋白质，对未变性的蛋白质无作用，因此，能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作用。临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。喷雾吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治疗毒蛇咬伤。 * 3 、胰蛋白酶的制备（一） * 可溶性固定化胰蛋白酶的制备（二） （1） 载体的合成：将2g经过碱处理的壳聚糖,置于40 mL二甲亚砜中,在搅拌下加入2g丁二酸酐,于65℃反应4-6 h。反应结束后过滤,固相用乙醇浸泡1 h,并将pH调到10左右。过滤后将沉淀物溶于蒸馏水中,用4倍体积的丙酮沉淀,沉淀物再依次用无水乙醇和丙酮洗涤,40℃真空干燥后得N-琥珀酰壳聚糖。称取1g N-琥珀酰壳聚糖,溶于20 mL磷酸盐缓冲液中,调节pH至4·