慢病毒感染细胞 操作手册.pdf

慢病毒感染细胞 实验方法 1/ 4 一、实验概述 培养生长状态良好的目的细胞，根据慢病毒感染预实验结果设计各组实验条件，进 行正式感染。若为荧光标记的慢病毒感染，参照预实验确定的感染时间点，于荧光显微 镜下观察GFP表达情况，荧光率达70-80％左右，细胞汇合度达80%左右，收集细胞进 入下游实验。若为抗性基因（如Puromycin ）标记的慢病毒感染，感染48 h-72h后， 使用抗生素筛选48h ，收集细胞汇合度70%-80%左右的生长状态良好的细胞进行下游 实验。 二、实验材料 1. 主要试剂 试剂名称 试剂来源 cat.No. 胎牛血清 Ausbian VS500T DMEM Corning 10-013-CVR 胰酶 生工生物工程（上海）股份有限公司 T0458-50G Puromycin Clontech 631305 D-Hanks 上海吉凯基因技术有限公司配制 2. 主要仪器 仪器名称 仪器来源 cat.No. 荧光显微镜 奥林帕斯 IX71 CO 培养箱 日本三洋 SANYO MCO-175 2 倒置显微镜 上海蔡康光学仪器有限公司 XDS-100 离心机 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 Fresco 21 生物安全柜 上海振样创空气净化设备有限公司 Bio 1200-Ⅱ-A2 三、实验步骤 1 ．准备目的细胞 （1） 从液氮罐中取出细胞冻存管 ，迅速放入37℃水浴中，并丌时摇动使其尽快解冻。 （2） 完全解冻后，1300 rpm ，离心3 min ，75%酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物 安全柜。 （3） 吸去冻存液上清，加入1 mL 新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含 有3 mL 完全培养基的6-cm dish 中，轻轻晃匀后置于37℃、5% CO 培养箱。 2 （4） 24 h 后更换一次培养液继续培养，待细胞汇合度达80%左右传代培养，保持细 胞良好的生长状态。 2/ 4 2 ．目的细胞慢病毒感染 （1） 贴壁细胞： 4 a. 处于对数生长期的细胞胰酶消化，完全培养基制成3-5×10 个/mL 细胞悬液， 并根据表 1 接种相应的细胞数到培养板中，继续培养保证感染时铺板量达到 15-30%左右。 表1. 贴壁细胞接种和病毒感染时感染液体积 底面积 接种体积 换液体积 2 96 孔板 0.3 cm 100 µl 100 µl 2 48 孔板 0.6 cm 200 µl 200 µl