蛋白质电泳技术课件.ppt

电泳技术 段天璇 一、基本理论 ? 1. 常用公式和术语 o E = U / L 电场强度 (V/cm)= 电压 (V)/ 电极间距 (cm) * 相对迁移率 m R = 蛋白质迁移距离 / 示踪染料迁移距离 o μ ep = v / E = l /( t E )= l L /( t U ) = q /(6 πrη ) (cm 2 /(s*V) ∵ F = qE = F =6 πrηv l ： 蛋白质迁移距离 o 电泳速度 v = μ ep E = μ ep J / K o 分离度 ? ? ? ? D U LD UL R eff 2 4 2 4 ? ? ? ? 影响电泳的环境因素 电泳速度 v = μ ep E= εζE /( C η ) o C : 6 π or 4 π ? E ? pH: pI(~4-7), 缓冲溶液 pH(~8-9.5), 向？极泳动 ? 离子强度 I: 0.02-0.2 ? 电渗 ? 温度：焦耳热 ? 介质：孔径、制胶重复性等 2. 分类 ? 按原理 : o 区带电泳 , ( 移界电泳 ), 稳态电泳 , 显微电泳 3. 电泳仪及附属设备 ? 提供稳定直流电源的装置 o 电压、电流、电功率稳定 o 脉冲式 ? 电压 o 常压电泳仪 (600V) : 净电荷和 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 o 高压电泳仪 (3kV): 载体两性电解质等电聚焦电泳 和 DNA 测序 o 超高压电泳 (30-50kV): 毛细管电泳 ? 电泳槽 o 板状电泳槽 ? 水平板 ? 垂直板 o 管状电泳槽 * 自由界面电泳槽 DYCP-33A 型 琼脂糖水平电泳仪 ( 槽 )( 中号 ) DYCZ-22B 型 单垂直电泳仪 ( 槽 ) （大号） ? 三苯基甲烷衍生物， -SO 3 - - 蛋白质的碱性 基团 —— 染料 - 蛋白质复合物。 o R 型 o G 型二甲花青亮蓝 - 甲基取代的三苯基甲烷衍 生物 ? 染色 o 固定蛋白质 - 染色 - 脱色 o 同时固定和染色 - 脱色 o 脱色 ? 30% 甲醇的 10% 乙酸溶液等 二、琼脂糖凝胶电泳 agarose gel electrophoresis ? 支持介质：琼脂糖 ? 结构： 1,3 连接的 β -D 半乳糖和 1,4 连接的 3,6 脱 水 α -D 半乳糖线性联结成琼脂糖，琼脂糖之间 以分子内和分子间氢键形成交联结构 ? 特点：大孔胶，适于核酸、线性 DNA, RNA 分 离分析 ? 分离原理： 0.2-50kb ? 操作形式：水平电泳、免疫 电泳、平板等电聚焦 Agarose D-galactose 3,6-anhydro L-galactose ? 性能指标 o 电内渗、胶凝温度、熔化温度、凝胶强度、 脱水收缩作用 o 纯度：硫酸根含量少，纯度高 ? 应用：核酸研究 , 不同浓度凝胶分离 200bp-50kb DNA ? 检测：荧光染料溴乙啶，电泳后染色 ? 操作过程： o 见 Agarose Gel Electrophoresis.ppt 三、醋酸纤维素薄膜 cellulose acetate film ? 纤维素 - 乙酰化 ? 特点 o 定量准确性提高：吸附少、染色背景脱色 o 较快速：电渗小 o 灵敏度高，样品用量少： 5 微克蛋白质 o 薄膜可保存 o 操作简单快速价廉 ? 应用领域：血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、 脱氢酶、多肽等 四、聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE ? 以 polyacrylamide gel 为分离介质 ? 分离原理：电荷密度 + 分子筛 ? 特点 ? 应用领域 ? 操作形式 o ( 圆盘电泳 ) o 垂直板电泳 o 水平板电泳 1. 聚丙烯酰胺凝胶 polyacrylamide gel, PAG ? 聚合 o 化学聚合 o 光聚合 ? 总浓度与交联度 单体 交联剂 催化剂 丙烯酰胺 + N,N - 亚甲基双丙烯酰胺 ———— PAG Acr Bis 加速剂 过硫铵 (AP)- 化学聚合 or 核黄素 V B12 – 光聚合 N,N,N,N - 四甲基乙二胺 TEMED 反应 影响因素