PTPRR、OPN以及miRNA-30e与外伤性癫痫的相关性研究.pdf

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摘 要 PTPRR 、OPN 以及miRNA-30e 与外伤性癫痫的相关性研究 摘 要 目的:通过建立外伤性癫痫( post-traumatic epilepsy ,PTE)大鼠模 型,检测蛋白酪氨酸磷酸酶受体R 型(PTPRR )和骨桥蛋白(osteopontin , OPN) 以及miR-30e-5p 在大鼠的皮层脑组织中的表达变化,探讨其与外 伤性癫痫的关联。 方法: 1、将 12 只大鼠,随机分为以下组别:正常对照组6 只和实验组 6 只。向实验组大鼠皮层注射0.4 mol/L 的氯化亚铁 (FeCl )溶液建立 2 PTE 模型。 2 、采用实时荧光定量 PCR 和Western blot 方法,检测正常对照组 和实验组的大鼠皮层脑组织中PTPRR、OPN、ERK、miR-30e-5p 的表 达水平。 3、进行细胞实验,验证PTPRR 、OPN、ERK 以及miR-30e-5p 之 间的关系。采用细胞转染的方法,形成大鼠小胶质细胞+Negtive Control 、 大鼠小胶质细胞+miR-30e-mimics 、大鼠小胶质细胞+miR-30e-inhibitor、 大鼠小胶质细胞+inhibitor N.C. 四组。分别在转染后的24h 、48h 、72h、 96h 四个时间点,采用荧光显微镜下观察和RT-qPCR 的方法检测miR- 30e-5p 的表达量来分析转染是否成功,同时以RT-qPCR 的方法检测每 组PTPRR 、OPN、ERK 的表达。 结果: 1、成功建立PTE 大鼠模型:取材显示实验组大鼠脑额叶注射区脑 组织明显软化,出现了棕黄色的含铁血黄素沉着;同时镜下观察可以见 到明显的GFAP 阳性表现;EEG 采集到了多种形式的异常电波,符合 1 中国政法大学硕士学位论文 PTPRR、OPN 以及miRNA-30e 与外伤性癫痫的相关性研究 痫性放电特征;行为学平均评分达到 4 分,观察到大鼠具有湿狗样抖 动、双前肢震颤、失去平衡、强直和痉挛等符合癫痫发作的表现。 2 、Rt-PCR 的检测结果为:与正常对照组相比,实验组中PTPRR 、 OPN、ERK 的mRNA 的表达量显著增高(P 0.0 1),miR-30e-5p 的表 达量显著降低(P 0.01 )。 3、Western blot 的检测结果:与正常对照组比较,实验组中PTPRR 、 OPN、ERK 蛋白表达量显著增高(P 0.0 1)。 4 、细胞实验结果:转染之后,分别在24h 、48h 、72h、96h 四个时 间点提取miR-30e ,Rt-PCR 结果显示,24 、48 、72、96 四个时间点的 N.C. 、N.C. inhibitor、miR-30e mimics、miR-30e inhibitor 两两比较,均 无显著差异(P0.05 )。荧光显微镜下观察,无明显荧光信号,但是引 物溶解曲线良好。由于转染效率很低,转染后的样本检测出的CT 值无 参考意义。使用N.C.组细胞,对PTPRR 、OPN、ERK2 三个基因重复 2 次检测,结果两次检测的内参CT 值均正常,而第一次检测三个基因 均无表达,第二次检测ERK2 和PTPRR 无表达,OPN 有表达。更换正 常大鼠脑组织神经元对引物验证,所有指标均有表达。 结论: 1、在FeCl2 诱发的外伤性癫痫的大鼠中,PTPRR、OPN、ERK 基 因表达上调,miR-30e-5p 表达下调,四者极可能参与了外伤性癫痫的 形成。 2 、在FeCl2 诱发的外伤性癫痫的大鼠中,miR-30e-5p 可能靶向调 控PTPRR 、OPN,miR-30e-5p 抑制PTPRR 和OPN 基因的表达。 3、miR-30e-5p 可能通过靶向调控PTPRR 、OPN 来调节ERK 通路, 从而发挥了使神经元兴奋,导致细胞损伤或凋亡的作用,最终诱发了外 伤性癫痫。 关键词:外伤性癫痫,PTP

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