分子生物学 常用分子生物学技术.docx

常用分子生物学技术 作者：Violax 分子杂交与印迹技术（重点；Western blot步骤） 印迹技术 定义：利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等膜上，使之成为固相化分子 适用分子：DNA，RNA，蛋白质 转膜方法：毛细作用，电转移 探针技术 定义：带有标记的核酸片段，具有特定的序列，能够与待测核酸片段互补结合，用来检测某一核酸样品中是否存在特定的核酸分子 标记物质：同位素，生物素，FITC 核酸分子杂交 定义：具有一定互补序列的不同来源的核苷酸单链在一定条件下按照碱基配对的原则形成杂交双链的过程 过程：用已知的探针去结合待测的靶序列 DNA印迹 (Southern blotting) 应用：检测某片段是否存在，不能检测片段内是否存在点突变 RNA印迹 (Northern blotting) 蛋白质的印迹 (Western blotting) 步骤见右 qPCR技术 原理：重复以待扩增的DNA为模板，以1对与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的催化下，沿模板链延伸直至完成2条新链的合成 过程：变性（95℃）→退火（90℃）→延伸（72℃） 所需成分：模板DNA，特异性引物，耐热DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+ 反转录（RT- PCR）技术 RNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA，以cDNA为模板通过PCR反应扩增基因 实时PCR（qPCR） 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过外标准或内标准对样品中的DNA/cDNA 模板的起始浓度进行定量 方法： 探针 如TaqMan荧光探针，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成 DNA结合染色 加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号 DNA测序 第一代技术 原理：变性-复性-延伸-终止（依靠ddNTP，其3’位无羟基，无法再连接下一个核苷酸） 第二代技术 高通量技术，优点是降低测序成本，提高测序速度，保持高准确性，主要使用llumina Llumina原理：加入荧光标记的dNTP后合成第一个碱基，因dNTP 3’端有叠氮基，子链无法延伸，合成停止。吸取多余的dNTP和酶，扫描荧光信号。之后用化学试剂清除叠氮基团和荧光基团。再次通入荧光标记的dNTP和酶，再合成第二个碱基，不断重复 基因芯片 实质：反向点杂交的集成 优点：利用计算机分析效率高，方便商品化 应用：基因诊断 分类： 点杂交（点DNA/RNA在膜上，变性，与带荧光的探针（20bp左右）结合杂交，洗膜脱去未结合的探针，之后显色） 若正常探针和异常探针均能杂交，则表明该基因为杂合子 反向点杂交（点探针在膜上，与有荧光的PCR产物结合杂交） 蛋白芯片 高度密集排列的一抗在支持物上，与待测蛋白反应标记后，再用二抗结合一抗显色 蛋白质分离方法 有机溶剂沉淀（如丙酮、乙醇） 原理：极性较大的有机溶剂破坏蛋白质的水化层（现负负不能排斥）导致蛋白质沉淀析出 注意：丙酮体积 10倍蛋白质溶液体积 盐析 原理：将(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等加入蛋白质溶液，中和电荷，破坏水化膜，使蛋白质沉淀 免疫沉淀 抗体抗原特异性结合后沉淀 透析超滤法 蛋白质不能透过半透膜而将蛋白质与小分子物质分开，而用正压或离心力使蛋白质透过有一定截流分子量的超滤膜，可浓缩Pr溶液 电泳 蛋白质在pH pI时，蛋白质在电场中带负电，向正极移动 蛋白质在pH pI时，蛋白质在电场中带正电，向负极移动 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） SDS的作用：裂解细胞，释放蛋白；使蛋白质变性，带很多电荷，避免蛋白自身电荷的干扰 二巯基乙醇的作用：破坏S-S键 等电聚焦电泳 制作含有不同pH层的凝胶板电泳蛋白质，蛋白将移动到等电点位置 双向电泳 = SDS+等电聚焦 层析 原理：待分离Pr（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的Pr颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的Pr组分两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而分离 离子交换层析 阴离子交换树脂：本身带正电荷可与负电荷物质结合 阳离子交换树脂：本身带负电荷可与正电荷物质结合 举例：阴离子交换树脂结合带负电样品，含电少的样品被低浓度Cl-洗脱，逐渐升高Cl-浓度，含电多的样品被高浓度Cl-洗脱，样品按照含电量多少依次分离（可在280nm吸光度处检测到蛋白含量） 凝胶过滤层析 原理：层析柱中填满由葡聚糖制成的小孔颗粒，蛋白质溶液加入后，小分子在孔中滞留，大分子不进入孔中直接流出，故而分离 超速离心 原理：蛋白质在重力作用下，下沉到某一位置浮力 = 重力时，沉降停止 应用：分离纯化蛋白，测定蛋白的分子量 沉降系数