农杆菌介导的烟草转化.pdfVIP

农杆菌介导的烟草转基因技术 一、实验目的 了解转基因的基本原理及操作方法。 二、基本原理 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens ）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农 杆菌中含有诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid ），简称为Ti 质粒。野生型农 杆菌的Ti 质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T-DNA 区（transferred DNA region ）， 含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region ），在T-DNA 的切割、转移与整合过程中起 作用。农杆菌可将T-DNA 插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定地遗传给后代。 我们将目的基因插入到经过改在的T-DNA 区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞 的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 三、材料 1、植物材料：烟草无菌苗 2 、农杆菌与载体：EHA105；PBI121 四、方法步骤 1、试剂的配制 （1）LB 固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂8g/L。 （2 ）液体MS/MT 培养基 PH ：5.8-6.0 （3 ）烟草共培养培养基：固体MS 培养基 （4 ）烟草筛选培养基： MS + （2.0mg/L ）6-BA + （0.3mg/L ）NAA + （30g/L ）蔗糖 + （400mg/L ）头孢霉素 + （50mg/L ）卡那霉素 + （7.5g/L ）琼脂 PH ：5.8-6.0 （5 ）烟草生根培养基：固体MS 培养基 2 、农杆菌侵染菌液的制备方法： （1）超净工作台紫外灯灭菌 15min，接种环酒精灯灼烧灭菌备用 （2 ）铺皿：LB （50mg/L 卡那霉素+25mg/L 利福平） （3 ）划线：用接种环沾取预转化的农杆菌菌液于铺好的培养基划“之”字或者“# ”字 （4 ）封皿，做标记 （5 ）28 ℃恒温培养1d-2d 1 （6 ）用无菌刀刮取适量菌体于50mL 液体MS 培养基中，28 ℃，180r/min 震荡培养1-2h 至 均匀悬浮液，紫外分光光度计测量菌液的OD600 值，用液体MS 调整浓度至OD600 值约为0.8- 1.0 为宜，备用。 3、外植体的制备 准备生长20d 健壮的烟草无菌苗，挑选接近植株顶端，完全舒展开且较大的叶片。将叶 片平铺在无菌滤纸上，左手拿镊子，右手拿刀。用镊子固定叶片，刀片切去也边缘和叶脉， 然后将叶片切成5mm ×5mm 的正方形，备用。 4 、侵染与共培养 取制备好的侵染菌液50mL 于三角瓶中，将切好的烟草叶片进入其中，摇晃使菌液与叶 片充分接触，侵染10min，期间摇晃三角瓶数次。然后用镊子将叶片夹出，放在无菌滤纸上， 吸干其表面的菌液，接种于共培养基上，于25 ℃培养室暗培养3d。 5、筛选培养和生根培养 从共培养基上取下叶片，预400mg/L 的头孢水中浸泡5min，浸泡两次，然后用无菌水 清洗三次，无菌滤纸吸干叶片表面的水分，接种于筛选培养基上，25 ℃光培养，期间每20d 继代一次，直至再生出芽。此时将再生芽切下置于生根培养基上诱导生根。 2