基于代谢组学探索大黄黄连泻心汤抗脑缺血的分子作用机制.pdf

摘 要 摘 要 脑中风目前作为全球第二大致死性疾病，以地区性高发病率、发病后高致残率、治 疗后高复发率的特性，对国民健康构成极大威胁。伤寒论中古方大黄黄连泻心汤在近代 药理学研究中有良好的脑保护作用，而大黄与黄连于单行用药上同样具有突出表现且在 临床方面应用频次较高。且现代中医研究“毒损脑络学说”病机备受推崇，该学说论证热 毒是引发中风的关键病因之一，其中清热泻火解毒药物可明显缓解病情。鉴于大黄黄连 泻心汤在临床中对脑保护作用良好，且大黄、黄连在单行用药上应用频次较高，却对机 体内相关的分子机制并不明确。本文将以大黄黄连泻心汤作为研究对象，对局灶脑缺血 小鼠进行灌胃给药，结合神经系数评分、脑梗死面积及脑含水量等药效指标，再将代谢 组学技术引入抗脑缺血的机制研究当中，通过对不同状态下小鼠血清和脑组织的检测、 数据的模式识别，探究大黄黄连泻心汤的抗脑缺血机制，挖掘相关的内源性代谢物和代 谢通路，探讨其相关分子机制，为中药预防脑缺血提供了新的思路。主要研究方法及结 果如下： 1 （）以线栓法建立局灶脑缺血小鼠模型，通过持续七天预防式给药灌胃。观察小鼠 生命状态并根据Longa神经功能评分法对小鼠神经功能进行程度区分。采取TTC染色 法并通过ImageJ-ProPLUS6.0软件图像识别模式对脑梗死面积进行测定，结合脑含水量 测定方法对脑水肿程度等多指标联合，对大黄黄连泻心汤抗脑缺血作用进行评价，结果 证实大黄黄连泻心汤确具有抗脑缺血效果。浓度为2.4g/ml 的大黄黄连泻心汤治疗效果 并无显著性，而给药剂量为1.2g/ml与0.6g/ml表现为明显的良好预防效果，表达为肢 体神经功能的恢复，脑梗死面积以及脑含水量较模型组明显缓解，并提示大黄黄连泻心 汤的量效关系呈非线性量效关系。 2 1.2g/ml 0.6 （）根据不同剂量大黄黄连泻心汤药效学指标评价选取有效剂量为 与 g/ml。运用GC-MS技术对不同状态下的小鼠的血清和脑组织进行分析测定，并结合NIST 08数据库和HMDB数据库等对内源性代谢物进行识别。采用MetaboAnalyst4.0软件通 过模式识别对血清和脑组织数据进行分析主成分分析、偏最小二乘分析、多元ROC 曲 线探索性分析等方法，证实局灶脑缺血小鼠造模成功复制，及局灶脑缺血模型对小鼠机 体代谢产生干扰作用。对不同状态下的小鼠数据样本分析推证大黄黄连泻心汤具备干预 小鼠的缓解神经功能损伤功能，并提示小鼠机体具有缓和为正常体征状态趋势。对模型 组与大黄黄连泻心汤组的小鼠血清和脑组织液比较其内源性物质的相关性，发现假手术 组、大黄黄连泻心汤中低剂量组与模型组相比，内源性物质的相对含量的变化具有相似 性，即与假手术组对比，模型组的差异性大于大黄黄连泻心汤组。根据 VIP＞1 结合非 参数检验 P＜0.05 筛选出血清、脑组织中的 12、7 种差异性代谢物；运用Pathway Analysis 数据库对差异性代谢物进行拓扑分析，选择Impact＞0.10 的通路，对血清和脑 9 2 组织差异性代谢产物分析发现 、 个代谢通路，推测大黄黄连泻心汤发挥干预作用可 I 哈尔滨商业大学硕士学位论文 能与谷氨酰胺和谷氨酸代谢、花生四烯酸代谢、淀粉和蔗糖代谢等通路有关；通过 Cytoscape 构建模块化结构对代谢内源物进行相关性分析。对血清和脑组织差异性代谢 3 4 产物的相关性分析和模块化分析分别发现 、 个模块之间关系密切，大黄黄连泻心汤 发挥干预作用可能与血清和脑组织3、4个模块代谢物的差别相关。 关键词 大黄黄连泻心汤；脑缺血；局灶脑缺血模型；代谢组学 II Abstract