纳米金杂化脂肪酶催化拆分反应研究.pdf

摘 要 摘 要 脂肪酶是一种绿色安全的重要工业酶制剂，因其良好的底物特异性，可以催化多种 反应，广泛应用于油脂加工、医药、香料等许多工业领域。农副产品和微生物是脂肪酶 的重要来源，由于天然脂肪酶存在稳定性差、立体选择性不理想和难以重复使用的问 题，适用范围受到很大限制。本文以皱褶假丝酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase ， CRL ）为模型酶，利用纳米金（Gold nanoparticles ，AuNPs ）优异的生物相容性以及独 特的理化性质，提出了两种新型杂化酶策略，制备CRL-AuNPs 杂化酶应用于拆分(R,S)- 萘普生甲酯，显著提高了产物的光学纯度和脂肪酶操作稳定性。文中改善脂肪酶性质的 方法也可应用于农副产品来源的脂肪酶，为扩大脂肪酶的人工目的性改性提供了理论支 持，主要研究内容和结果如下： 构建酶促拆分反应体系，以100 mg 的CRL 为催化剂在微水相中进行手性拆分，于 35 ℃反应96 h 。实验结果表明转化率(C)为23.2% ，产物对映体过量值(ee )为94.8%，对 p 映体比率(E)为 50.3 。采用高效液相色谱对反应剩余底物和水解产物定性分析。在不可 逆动力学拆分条件下，建立了参数方程并据此绘制C 与ee 和ee 的理论曲线图。 s p 利用柠檬酸钠还原氯金酸形成不同粒径 AuNPs ，CRL 与 AuNPs 在离子键和物理吸 附的共同作用下获得CRL-AuNPs①杂化酶，研究结果显示，在 10 mL 浓度为 10mg/mL 的CRL 酶液中加入60 mL 平均粒径为14 nm 的纳米金，杂化温度为30 ℃，杂化时间为 24 h 时制备的杂化酶拆分效果最好。此时拆分反应 C 为 20.0%，ee 为 97.3%，E 为 p 94.1 。并利用紫外、荧光、FTIR 、TEM 等检测手段对制备成功的 CRL-AuNPs①杂化酶 进行表征并探究其二级结构的变化。 利用 CRL 上的还原性氨基酸原位还原氯金酸一步合成 CRL-AuNPs②杂化酶，利用 紫外、荧光、FTIR 、TEM、XPS 等手段对制备的 CRL-AuNPs②杂化酶进行表征，通过 透射电镜观察到AuNPs 呈圆球形均匀分散，XPS 结果表明Au4f7/2 和Au4f5/2 结合能分别 为83.5 和87.2 eV，证明Au (Ш) 已还原为Au (0) 。拆分结果表明，杂化最优条件为取10 mL 浓度10 mg/mL 的CRL 酶液与1 mL 浓度1 mg/L 的氯金酸溶液，放入转速100 rpm 温度30 ℃的摇床，杂化15 h 获得CRL-AuNPs②杂化酶，此条件下杂化酶C 为21.4% ， ee 为98.6%，E 为179.3 。 p - I - 哈尔滨商业大学硕士学位论文 对最优制备条件下的 CRL-AuNPs①和 CRL-AuNPs②杂化酶进行催化特性分析， CRL-AuNPs①和 CRL-AuNPs②杂化酶分别保留了 CRL 纯酶 86.2%和 92.2%的活性，E 值与游离酶相比提高了87.1%和256.5%，经过6 次反复批式反应后酶活力分别保持在初 始值的57.3%和69.4%，且CRL-AuNPs②的立体选择性几乎未改变。研究发现经AuNPs 杂化改造后的脂肪酶，二级结构发生变化，导致立体选择性显著提高，稳定性有所提 升，便于重复使用。 关键词：手性拆分；纳米金；杂化酶；二级结构；对映体比率 - II -