流式细胞术描述.pptxVIP

流式细胞术Flow cytometry，FCM;1. 流式细胞仪(Flow Cytometer):是现代物理电子技术、激光技术、计算机技术于一体的先进科学技术设备。 2. 流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。;第一节 流式细胞仪基本结构与原理 第二节 流式细胞术的数据分析 第三节 流式细胞仪分析的技术要求 第四节 流式细胞术的应用;; 四、流式细胞术的样本设置;阴性对照;阳性对照;空白对照;补偿对照;2.一套完整的流式细胞术检测样本设置;三、流式细胞术基本原理;1.流式细胞术分析的基本原理;R1：淋巴细胞 R2：单核细胞 R3：粒细胞 R4：红细胞裂解碎片和少量血小板; 调节电压可改变目的细胞的荧光信号强弱，那么如何判断特异性荧光信号的有无？ 需要设置阴性对照以确定细胞自身基础荧光域值，并通过它来判断待测样本中是否有特异性荧光信号。 ; 首先通过调节电压将阴性对照细胞的基础荧光域值调至阴性致信区内，然后对阴性置信区进行界定，大于阴性置信区的荧光信号为特异性荧光信号。 对于流式样本来说，设置阴性对照是必须的，且阴性置信区一旦设定，将作为后续样本的阴、阳性判断的基础，不能随意变动。;2.流式细胞术分选的基本原理;3.流式细胞仪荧光补偿设置;（2）FITC标记抗体/IgGPE：(IgGPE为同型对照) 此时电压已通过阴性对照设定，绝不能变动。当PE探测器检测到的FITC信号恰好完全消除时，补偿便是正确的，即FITC单阳性细胞的PE信号与阴性对照的PE信号一致。 注：首先要知道双阴性细胞的情况，其次是在检测管中，必须要有FITC单阳性细胞和双阴性细胞。;;（3）IgGFITC/PE标记抗体：同理，将进入FITC探测器的PE信号降至本底一致，前提是必须有PE单阳性细胞和双阴性细胞。 （4）当设置好以上补偿条件后，即补偿调节完毕。;（5）进行多色分析时，必须做各荧光间的补偿。方法同上，先准备各种标记的荧光阴性对照，确定合适的电压，并逐一调节各荧光标记抗体，与其他荧光对照，然后调节特异性荧光对每个荧光的补偿。;二、流式细胞术的重要术语;1.前向散射与侧向散射;;;2.Coulter效应与电子体积;3.荧光信号及其面积与宽度;;4.光谱重叠与荧光补偿;5.细胞基础荧光域值与阴性对照置信区间;一、流式细胞仪基本结构与功能;2. 流式细胞仪的基本功能与应用;1. 流式细胞仪基本结构;流动室与液流系统;;;;激发光源;信号收集与光电转换系统;计算机与分析系统;第二节 流式细胞术的数据分析;二、数据的显示与分析;;; 能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系，横、纵坐标分别代表两个独立参数，平面上每一个点表示具有相应坐标值的细胞。;看图技巧：1.先看x，y轴，了解代表参数的意义；2.再看其四个象限，并了解各象限意义；3.比较几个散点图时，关键看四象限划分区间的位置以及各象限散点的密度；4.数据统计时，检测目的物一般用各象限区内的细胞数占门内细胞百分比或用平均荧光强度表示。; 用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相 同，不同的等高线上细胞数不同。;;;三、设门;; 一、样品制备：单细胞悬液 二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 三、质量控制;一、样品制备;; 单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法 使细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗。 悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打制备 成单细胞悬液。; 机械法：剪碎法、网搓法、研磨法。 酶处理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等。 化学试剂处理法：EDTA、EGTA等。 表面活性剂处理法： Triton-100、皂素等。; 机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量。 如用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等， 也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片 的干扰。 酶学法、化学法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成份的不良影响。FCM所测细胞是单个分散状态；对细胞团块，细胞碎片尽可能少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光染色处理不受影响。 ;防止细胞自溶，保持细胞膜原有的特性保存的方法： 1、深低温保存法：深低温冰箱，保存一年。 2、乙醇与甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇。 3、甲醛或多聚甲醛固定法：细胞不具有生物活性，但 细胞表面荧光染色分析不受影响。 ; 染料的选择和标记染色保证了荧光信号的产生 （一）免疫荧光标记最常用的荧光染料; 用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在 488nm波长激发光激发后产生的发射波长激发另一荧光 染料