研究生选修课细胞生物学实验技术.ppt

; ;; 显微技术 细胞分离技术 细胞培养技术 细胞组分的分级分离 细胞示踪技术 细胞分子生物学技术;一、显微镜技术 microscopy μm 微米 = 10-6 m nm 纳米 = 10-9 m ? 埃 = 10-10 m (一) 光学显微镜技术 利用光线照明,将微小 物体形成放大影像的 仪器 ; 1.显微镜的分辨率 显微镜或人眼在25cm的明视距离处,能分辨 被检物体微细结构最小间隔的能力。 R = 光学显微镜的分辨极限0.2μm ;100μm ; 2.光镜标本切片的制备 (1) 固定 定义：将组织浸入??学试剂中，通过在细 胞中大分子间形成交联，保持细胞 中原有结构的形态和位置的过程。 固定的目的： A 防止组织自溶或腐败 B 保持细胞原有的形态 C 保持细胞各种成分的原有位置 常用固定剂：乙醇、甲醛、戊二醛 ; (2) 包埋 定义：将组织块包入包埋剂使组织硬化的过 程。 常用的包埋剂：液体石蜡、树脂 (3) 切片 1-10 μm ;（4）染色 采用某些化学物质特异性或选择性地与细 胞内的某些成分相互作用，从而原位显示 细胞某种成分或结构的方法 A 选择性染色 考马斯亮蓝 – 蛋白质 Brachet反应 ;HE染色; B 特异性染色 酶 + 底物 抗原 + 抗体;3.荧光显微镜技术 (1) 原理 荧光分子在受到光照射后，可吸收特定波 长的短波光线，并发射出比原来吸收波长 更长的光 ;（2）荧光显微镜的基本构造 A 紫外光光源 B 二向色镜：反射短波光线，透过长波光线 C 滤光片 ;（3）常用的荧光染料 荧光素 罗丹明 FITC;（4）应用 A 免疫荧光显微技术 （Immunofluorescence microscopy） 抗体 + 荧光染料 ;;;;B 绿色荧光蛋白 GFP ;;4.相差显微镜 （phase contrast microscope） (1)原理 波长 颜色 振幅 亮度 速度 相位 ;(2)应用 活体细胞观察;;倒置相差显微镜;5.暗视野显微镜（dark-field microscope ） ;分辨率： 典型的动物细胞 ——— 10～20 ?m 一般的细菌和线粒体—— 0.5?m (500nm) 普通显微镜 ———— 0.2μm(200nm) 暗视野显微镜———— 0.004-0.2μm(4-200nm) 应用： 能观察物体轮廓,分不清内部的微细结构。 用以观察活细胞内的细胞核、线粒体, 以及 液体介质中的细菌等微粒的运动 。;;6.显微电影摄影;;7.激光扫描共焦显微镜 （ Laser Scanning Confocal Microscope） (1)原理 在显微镜基础上配置激光光源，扫描装置， 共轭聚焦装置和检测系统而形成的显微镜。;; 激光作扫描光源 扫描焦平面上样品，得样品切面像 载物台上微量步进马达使载物台 上下移动,改变焦平面 得不同层次的切面图像 计算机图像三维重组获样品立体图像; （2）应用 A 细胞的三维重建 B 细胞定量荧光检测 DNA RNA 蛋白质含量 C 细胞内Ca2+ pH动态检测 D 细胞间通讯;果蝇胚胎原肠胚;;（二）电子显微镜技术 利用电子与固体样品作用时所发出的信息, 对样品进行微区观察和分析的技术 亚显微结构 超微结构 1.电子显微镜的特点 高分辨率